花粉的正常发育和成熟决定着水稻结实和产量的高低,而花粉发育后期的淀粉积累是水稻花粉粒成熟的关键过程之一。然而,淀粉在花粉中积累的调控机制尚不清楚。L型凝集素类受体蛋白激酶是一类能够与配体结合且具有激酶活性的蛋白受体,具有多种生物学功能,如参与植物抗病防御反应、生长发育和非生物胁迫反应等。已有研究表明L型凝集素类受体蛋白激酶亦参与调控水稻的花粉发育。因此,深入研究水稻L型凝集素类受体蛋白激酶基因的功能对于完善水稻花粉发育调控网络具有重要意义。本研究针对一份雄性不育突变体材料（abnormal pollen 1,ap1）,展开了系统的表型分析、基因克隆和功能研究,并进一步利用转录组、磷酸化蛋白组及蛋白互作等手段研究了AP1的生化功能。本研究证实AP1通过与一个花粉成熟期淀粉积累的关键蛋白—OsUGP2（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶,UGPase）互作,并直接靶向磷酸化OsUGP2来影响其酶活性,从而促进水稻花粉成熟期淀粉积累。主要研究结果如下:1.与野生型相比,ap1突变体的花药略小,呈淡黄色,FDA和I2-KI花粉染色结果表明ap1的花粉粒无活性。显微观察发现ap1的花粉粒呈空瘪状,缺乏典型的内含物,淀粉含量极显著减少。花粉母细胞减数分裂观察结果显示AP1的突变并未明显影响减数分裂过程。半薄切片、透射电镜及扫描电镜观察结果显示,AP1的功能障碍不仅导致花粉内含物积累的缺陷,还影响花粉内壁的发育和萌发孔的形成。2.利用Mut Map重测序法将ap1突变位点定位于2号染色体长臂座号为LOC＿Os02g26160的基因上,其上一个C/T改变的SNP引入终止密码子,导致蛋白翻译提前终止,且该SNP与雄性不育表型共分离。基因注释显示AP1编码一个L型凝集素类受体激酶（Lec RLK）。进一步利用CRISPR/Cas9技术获得了AP1在日本晴背景下的敲除突变体株系cr-1和cr-2;纯合突变植株的表型与ap1突变体相似,均为花粉内含物缺失,雄性不育;随后分别利用93-11和日本晴背景下的ap1/cr突变体进行功能互补分析,两种背景阳性植株均表现为类似野生型的雄性育性恢复。以上结果证实AP1为控制水稻花粉发育的关键基因。3.qRT-PCR结果显示AP1分别在花药发育第8-9期和第11-12期的小穗中表达量较高,而在其它组织表达量较低;GUS组织化学染色和原位杂交实验均显示该基因在花药发育第11期的小孢子中优势表达。另一方面,亚细胞定位显示AP1蛋白定位于细胞质膜。4.转录组分析发现蔗糖/淀粉代谢途径中多个涉及糖信号/代谢有关的基因在突变体中下调,支持了AP1参与调控花粉淀粉积累的可能性;进一步的体外生化实验表明AP1蛋白具有磷酸化功能;磷酸化蛋白组分析发现蔗糖/淀粉代谢途径中多个蛋白的磷酸化水平在突变体中下调,其中包含一个与花粉后期发育相关的蛋白OsUGP2。由于OsUGP2在野生型和突变体中的转录水平无明显差异,推测OsUGP2蛋白磷酸化水平下调是AP1蛋白磷酸化功能丧失的直接结果。5.qRT-PCR和亚细胞共定位结果表明OsUGP2与AP1具有一定的时空重叠特性。进一步通过酵母双杂交、双分子荧光互补、荧光素酶互补和GST-pull-down实验,证实了AP1通过其激酶结构域直接与OsUGP2相互作用,而ap1突变型蛋白在上述实验中均不能与OsUGP2互作,表明AP1的激酶结构域是其蛋白相互作用所必要的。6.体外磷酸化及磷酸化蛋白组分析显示AP1能够自磷酸化及直接磷酸化OsUGP2的第151和413位点的丝氨酸,而ap1突变型蛋白则既不能自磷酸化,也不能磷酸化OsUGP2;我们进一步构建了模拟OsUGP2持续磷酸化的OsUGP2DD和阻止磷酸化的OsUGP2AA,结果显示,OsUGP2AA被AP1磷酸化的程度明显减弱。以上结果表明AP1的激酶结构域是磷酸化所必需的,而OsUGP2蛋白第151和413位点丝氨酸也是其关键的磷酸化位点。体外酶活性分析显示AP1能够促进OsUGP2蛋白的酶活,而ap1突变型蛋白则对OsUGP2的酶活无明显影响。其中,AP1与OsUGP2DD组合的酶活性高于AP1与OsUGP2组合,二者的酶活性均远远高于AP1与OsUGP2AA组合。进一步在烟草叶片中瞬时表达上述组合,淀粉含量测定结果亦与之相符。上述体内、体外结果表明AP1能够通过磷酸化修饰来促进OsUGP2的酶活性,从而影响花粉淀粉合成。综上所述,本研究克隆了一个水稻花粉育性调控基因AP1,其编码一个L型凝集素类受体蛋白激酶。AP1蛋白通过与OsUGP2的蛋白互作直接靶向磷酸化后者,促进了OsUGP2的酶活性,进而调控水稻花粉中淀粉的合成与积累。