【摘 要】
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目的本项研究旨在探究tRNA来源的小RNA（tRNA-derived small RNA,ts RNA）在主动脉夹层（Aortic dissection,AD）中对血管平滑肌细胞功能的调控作用及机制,为主动脉夹层的预防及治疗提供新的精准靶标。方法（1）经过文献查阅的方法,筛选到一条应激诱导RNA（tRNA-derived stress-induced RNA,tiRNA）,即5’tiRNA-Cys
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目的本项研究旨在探究tRNA来源的小RNA（tRNA-derived small RNA,ts RNA）在主动脉夹层（Aortic dissection,AD）中对血管平滑肌细胞功能的调控作用及机制,为主动脉夹层的预防及治疗提供新的精准靶标。方法（1）经过文献查阅的方法,筛选到一条应激诱导RNA（tRNA-derived stress-induced RNA,tiRNA）,即5’tiRNA-Cys-GCA,同时并未有关于tiRNA在心血管疾病方面的研究。临床收集AD患者病变动脉及正常动脉样本,通过荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）进行细胞定位并量化5’tiRNA-Cys-GCA的表达量。构建主动脉夹层小鼠模型,使用RT-qPCR检测5’tiRNA-Cys-GCA的表达情况。（2）构建5’tiRNA-Cys-GCA模拟物及抑制物并转染人主动脉血管平滑肌细胞（Human aortic vascular smooth muscle cells,HASMCs）,通过RT-qPCR验证其转染效率。使用CCK8及Ed U实验检测细胞的增殖情况,划痕和transwell检测细胞迁移情况,Western blot检测收缩标记蛋白（α-SMA,CNN1及MHC）的表达情况。使用TUNEL及Western blot检测细胞凋亡情况和凋亡蛋白的表达水平。（3）使用生物学软件预测5’tiRNA-Cys-GCA的潜在下游靶标,再通过pull down实验和文献资料筛选出STAT4作为最佳的下游靶标。使用RT-qPCR和Western blot验证5’tiRNA-Cys-GCA对STAT4的调控。通过生物学软件预测5’tiRNA-Cys-GCA和STAT4的结合位点并使用双荧光素酶报告基因进行验证。（4）构建针对STAT4的小干扰RNA并通过Western blot验证其敲低效率。通过CCK8和Ed U,划痕和transwell以及Western blot检测敲低STAT4对ox-LDL处理后的血管平滑肌细胞功能的影响。（5）构建5’tiRNA-Cys-GCA类似物对主动脉夹层小鼠进行治疗,并计算各组小鼠的生存率。RT-qPCR检测各组小鼠主动脉中5’tiRNA-Cys-GCA的表达情况。使用HE染色法对小鼠主动脉组织进行染色并检测中膜厚度的变化情况。使用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测STAT4蛋白在各组小鼠主动脉组织中的表达情况。结果（1）5’tiRNA-Cys-GCA在血管平滑肌细胞中高丰度表达,并在人主动脉夹层样本和ox-LDL处理的血管平滑肌细胞中下调。（2）RT-qPCR验证5’tiRNA-Cys-GCA模拟物及抑制物具有良好的转染效果。与对照组相比,过表达5’tiRNA-Cys-GCA的血管平滑肌细胞的增殖、迁移和表型转换能力明显被抑制。敲低5’tiRNA-Cys-GCA的血管平滑肌细胞具有更高的增殖、迁移和表型转换能力。而且,5’tiRNA-Cys-GCA的过表达能够明显抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移和表型转换。（3）原位杂交实验结果显示5’tiRNA-Cys-GCA定位于细胞质,通过生物信息学预测下游靶标,使用pull down、RT-qPCR及双荧光素酶报告基因验证,STAT4被筛选并鉴定为5’tiRNA-Cys-GCA最佳的下游靶标。（4）敲低STAT4抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移和表型转换,并能够被5’tiRNA-Cys-GCA抑制物逆转。结论我们的研究首次揭示了5’tiRNA-Cys-GCA可能通过靶向STAT4进而影响血管平滑肌细胞的增殖、迁移和表型转换,并潜在抑制主动脉夹层疾病的发生和发展过程。这项研究为5’tiRNA-Cys-GCA成为主动脉夹层潜在的诊断标志物及治疗靶标奠定了理论基础,并可能为临床诊疗提供一种新的治疗战略。
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