汉坦病毒（Hantavirus,HV）是布尼亚病毒科的RNA病毒,是引起人肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征的病原。大别山病毒（Dabieshan virus,DBSV）是新型蜱传病毒,属于布尼亚病毒科、汉坦病毒属,于2000年在中国安徽省大别山区的社鼠中首次分离到,因其与汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）亲缘关系较近,最初被认为是汉滩病毒的一个亚型,于2015年被国际病毒分类委员会（ICTV）正式命名。近年来,新型蜱传病毒因其能诱发严重的人类疾病而受到了社会上的广泛关注。虽然DBSV对人类和动物的致病性尚不清楚,但汉坦病毒可以进行跨物种传播且DBSV与HTNV亲缘性较近,怀疑其参与了人类的发热性疾病。因此,迫切需要建立分子生物学和血清学检测方法对蜱虫及人畜群体中DBSV的流行情况进行调查研究。2020年宏基因组测序发现辽宁地区已经存在DBSV,因此本文对辽宁地区DBSV的感染现状进行初步研究,具体研究内容如下:1.DBSV PCR检测方法的建立及辽宁部分地区蜱、人及野生动物中的病原检测2020年5-9月,在辽宁大部分地区进行蜱虫样本的采集,以地区分类后（分为:辽东、辽西、辽南、辽中南）进行宏基因组测序,测序结果显示:辽东及辽西地区蜱中存在普遍的DBSV感染情况。本章试验建立了一种PCR检测方法对辽宁地区蜱、人及野生动物中的DBSV进行检测。结果:辽宁地区蜱中DBSV阳性率为13.80%,人及野生动物中DBSV阳性率从0到100%不等,普遍存在DBSV感染情况。2.DBSV N蛋白的生物学特性分析及原核表达和纯化根据宏基因组测序分析的基因序列,针对DBSV的N基因设计一对引物,以普通PCR检测DBSV为阳性的蜱虫核酸为模板,通过大肠杆菌原核表达系统得到重组蛋白-p ET28a-DBSV-NP,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定后对重组蛋白进行纯化,得到大量高纯度的重组蛋白。3.DBSV N蛋白多克隆抗体的制备用纯化的DBSV重组N蛋白免疫新西兰大白兔,获得效价为1:32000的多克隆抗体,并通过Western blot验证其具有较好的特异性。本试验成功制备抗DBSV N重组蛋白兔多克隆抗体。4.DBSV N蛋白间接ELISA检测方法的建立及初步应用以重组N蛋白作为包被抗原,DBSV标准阳性血清为一抗,HRP标记的羊抗兔Ig G为二抗,通过优化反应条件,建立了检测DBSV抗体的间接ELISA方法。其中重组N蛋白作为包被抗原的浓度是2.5μg/m L,37℃包被2h,最佳封闭条件为2%BSA 37℃封闭1h,血清（1000倍稀释）37℃作用15min,二抗（2000倍稀释）37℃作用1h,底物TMB 37℃显色20min。应用建立的间接ELISA方法检测临床（人、牛、羊、猪）血清,各选取其中50份OD450值较低的血清,且以其平均值加上3倍的标准差（（?）+3SD）为阴阳性血清临界值。特异性试验证实该方法具有良好的特异性,不与其他病毒（阿龙山病毒、新布尼亚病毒）的抗体产生交叉反应。批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于5%,表明建立的间接ELISA方法具有很好的重复性和稳定性。应用建立的间接ELISA方法对来自辽宁各地的临床人、牛、羊、猪血清进行检测,检出DBSV抗体阳性样品共75份,阳性率为7.4%。综上,本试验建立的PCR方法可以用于DBSV病原检测,间接ELISA方法可用于临床血清中DBSV抗体的检测,并获得了大量高纯度的DBSV重组N蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为临床上人群及动物群体中DBSV感染现状的研究提供了一定的基础。