目的由于缺乏有效的治疗手段,胰腺癌患者的5年生存率低于5%。即使使用目前的一线化疗药物,吉西他滨(Gemcitabine,Gem),中晚期患者的中位总生存期只有5.0到7.2个月。因此,目前的胰腺癌治疗领域亟待开发新的治疗策略。由于缺乏血液供应,在胰腺癌组织中存在大量的低氧区域。肿瘤细胞之所以能够在低氧环境下生存,是因为在肿瘤细胞内部激活了大量的信号通路,在这其中低氧诱导因子1(HIF1,由氧浓度调节的HIF1α亚基和组成型表达的HIF1β亚基组成)是最重要的转录因子。近些年,HIF1α已经成为一个新的肿瘤治疗靶点,许多HIF-1α抑制剂被开发出来,特别是化学小分子抑制剂。但由于缺乏特异性,这些化学小分子抑制剂在临床试验中都显示出明显的副作用。利用小干扰RNA(si RNA)的RNA干扰技术是一种有效的选择性抑制特定基因表达的方法。但是,裸的si RNA在血液循环中的半衰期低于1个小时,而且难以穿过细胞膜进入细胞。利用si RNA进行体内基因治疗的关键就是寻找一个安全有效的基因输运纳米载体。目前,用于si RNA输运的生物材料主要有两类,聚合物和脂质体。尽管有许多生物可降解的阳离子聚合物和阳离子脂质体被开发出来,但其表面高的正电荷导致的毒性依然是个问题。最近,一种新的si RNA载体被研究出来,这就是磷脂-聚合物混合型纳米载体。这种新型纳米载体的结构一般为:核心是一个聚合物,然后在表面覆盖一个磷脂单分子层或双分子层,这样就能将两种载体的优势结合起来。但目前使用这种载体进行药物和si RNA的联合输运的研究仍然很少。在这项研究中,我们设计了一种磷脂-聚合物混合型纳米载体,可以高效的同时输运吉西他滨和针对HIF1α的si RNA(si-HIF1α)用于胰腺癌的治疗。所用的材料都已经被FDA批准用作临床药物或食品添加剂。除了纳米载体的设计和合成外,我们还会重点关注外层的磷脂双分子层对纳米载体稳定性、药物渗漏速率和si RNA输运效率的影响,并对比不同纳米制剂在小鼠胰腺癌皮下模型和原位模型中的抗肿瘤效应。方法一、HIF1α在胰腺癌细胞中对细胞增殖和吉西他滨敏感性的影响。1、利用Lipofactamine 2000将si RNA转染至Panc-1细胞中,并用western分析HIF1α的表达水平.2、干扰HIF1α的表达后,利用CCK-8试剂盒检测Panc-1细胞的增殖速度。3、将si-HIF1α和阴性对照si RNA(si-ctrl)转染入Panc-1细胞中,用Gem对细胞进行处理后,利用CCK-8试剂盒检测细胞的生存率,来研究HIF1α对吉西他滨敏感性的影响。二、纳米载体的设计、合成和表征。1、设计一种新型的磷脂-聚合物混合型纳米载体纳米载体用于同时输运Gem和si-HIF1α:设计出的纳米载体由一个阳离子聚合物核心和表面覆盖的PEG化的磷脂双分子层组成。核心的阳离子聚合物是由EPL改性后的m PEG-PLGA(ENPs),具有很高的表面正电荷,Gem可以被有效的包裹在其亲水性核心,同时表面通过静电吸附带有负电荷的si-HIF1α;吸附之后,表面再覆盖一层PEG化的磷脂双分子层(LENPs),其可以减少Gem和si RNA的渗漏,并且提高纳米载体在血液循环中的稳定性。2、位于LENPs核心的ENPs通过复乳法进行合成;表面的磷脂层则通过超声薄膜法进行自组装。3、不同纳米载体的粒径分布和表面电位通过动态光散射(DLS)进行测量。4、利用透射电子显微镜(TEM)进行不同纳米载体的内部结构观察。5、通过高效液相色谱法(HPLC)测量ENPs对吉西他滨的包载率;对核酸的吸附能力则通过表面电位的变化以及核酸电迁移率变化进行检测。6、将不同的纳米载体在FBS里孵育不同时间后,通过观察纳米粒子的粒径分布变化来检测纳米载体的血清稳定性。7、利用HPLC和电泳检测从纳米载体上释放出来的Gem和核酸。三、纳米粒子在体内外的siRNA输运效果的表征。1、利用荧光物质标记siRNA后,通过激光共聚焦显微镜观察细胞对LENPs输运的si RNA的摄取及其细胞内定位。2、利用FITC标记的鬼笔环肽对细胞内的Actin进行染色并通过激光共聚焦显微镜观察,来检测针对Actin的si RNA的干扰效果;si-HIF1α的干扰效果则通过免疫印迹和实时定量反转录PCR进行检测。3、利用纳米载体进行载运荧光物质标记的si RNA后,将其注射入小鼠体内,利用小鼠活体成像系统检测血中和器官中的荧光强度,来确定si RNA在体内的半衰期和肿瘤靶向性。四、不同纳米制剂在体内外的抗肿瘤效果评价1、利用不同纳米制剂对细胞进行处理后,细胞的存活率通过CCK-8试剂盒进行检测,来确定不同纳米制剂的体外抗肿瘤效果。2、体内的抗肿瘤效果分别在小鼠的胰腺癌皮下移植瘤和原位移植瘤模型中进行检测。结果干扰HIF1α的表达后,Panc-1细胞的增殖明显受到抑制,同时其对Gem的敏感性也明显提高。通过复乳法,我们成功合成出ENPs,其具有良好的包载Gem的能力(在m PEG-PLGA:Gem的质量比为80:1时,包载率最高,为42%),同时ENPs具有很强的吸附核酸的能力。与ENP-Gem-DNA相比,表面覆盖了磷脂双分子层的LENP-Gem-DNA的结构和粒径没有明显区别,但其表面电位变为-34m V。由于表面覆盖的磷脂双分子层,LENP-Gem-DNA在血清中的稳定性比ENP-Gem-DNA更好,同时DNA的渗漏也明显减少;而无论在p H7.4还是p H4.4的条件下,LENP-Gem的Gem渗漏都低于ENP-Gem。LENPs载运的si RNA可以被细胞摄取,进入细胞的溶酶体内,并最终从溶酶体里面逃逸出来。LENPs载运的si RNA的体外干扰效果明显强于ENPs载运的si RNA。在体内,LENPs的稳定性优于ENPs,其循环时间更长。这些特性都有利于LENPs通过增强肿瘤血管效应从而实现在肿瘤组织的靶向富集。最终,在小鼠皮下移植瘤模型中LENP-Gem-si-HIF1α展现出明显强于ENP-Gem-si-HIF1α的协同抗肿瘤效应,另外在原位胰腺癌模型中,LENP-Gem-si-HIF1α可以有效地抑制肿瘤转移。结论总而言之,我们合成了一种具有生物相容性的磷脂-聚合物混合型纳米载体,实现了si-HIF1α和Gem的共同转运,这种纳米药物在皮下肿瘤模型和原位胰腺癌模型中展示出良好的抗肿瘤效果。这种新型纳米载体具有优秀的血液循环稳定性,同时具有优秀的体内si RNA载运功能,为将来si RNA和化疗药物在纳米药物中的联合输运奠定了基础。