论文部分内容阅读
谷蓝（Indigoidine）,来源于微生物,无毒无害,由两分子的谷氨酰胺氧化环化而来,属于靛蓝色素类,在印染、医疗、化妆品等行业都有着非常重要的商业价值。随着需求量的增加,化学法合成蓝色素被广泛应用,但由于化工原料对环境造成的巨大破坏,因此,微生物法合成蓝色素这一绿色环保的方法受到国内外广大学者的重视。目前,关于微生物合成靛蓝色素报道最多的是以吲哚为底物合成靛蓝Indigo,此反应会产生靛玉红等其他副产物,吲哚作为底物价格昂贵;Indigo的稳定性明显差于Indigoidine,因此在工业中寻求一种能够替代靛蓝Indigo、成本更加低廉、高效高产的蓝色素成为当下研究的重点。本研究首先对24种来源不同的谷蓝合成酶构建系统进化树,从不同分支上选取并克隆了5个来源不同的谷蓝合成酶基因,与来自Streptomyce的4′-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase）进行双基因质粒构建,在大肠杆菌中进行表达。结果表明在30℃下发酵24 h,来源于Streptomyces lavendulae的ind1B合成谷蓝色素的能力最强,产量达到14.4 mg/L。接着对不同来源的PPTase进行筛选,结果表明来源于Bacillus subtilis的sfp合成谷蓝产量最高,24 h达24.3 mg/L。以筛选出的工程菌株BW/pYB-ind1B-sfp作为出发菌株,对发酵条件优化结果表明,20℃下发酵48 h,谷蓝色素的产量达到354.9 mg/L;外源添加20 mM谷氨酰胺发酵48 h,谷蓝产量增长到368.4 mg/L。为了进一步提高谷蓝色素的产量,采用全细胞催化方法合成谷蓝。敲除大肠杆菌gln A基因,构建工程菌株BW△gln A/pYB-ind1B-sfp,以谷氨酰胺为底物进行全细胞催化,对诱导温度（20℃、25℃、30℃）、全细胞催化温度（20℃、25℃、30℃）、缓冲液的pH值（6.0、7.0、8.0、9.0）、L-谷氨酰胺的添加量（5、10、15、20、40、60、80、100 mM）的条件进行优化,最终确定,当诱导温度为30℃、全细胞催化温度为20℃、缓冲液pH=9.0及L-谷氨酰胺添加量为40 mM时,菌体生物量为30OD,转化24 h后谷蓝的产量可达到2.0 g/L,谷氨酰胺转化率为40.7%。在工业生产上,谷氨酸相比于谷氨酰胺具有成本优势,本实验将谷氨酸替代谷氨酰胺生产谷蓝色素。首先,克隆来自于枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶（gluton）,构建了三基因共表达的工程菌株BW/pYB-ind1B-sfp-gluton,20℃发酵24 h后谷蓝色素产量为192 mg/L,在外源添加5 mM谷氨酸直接发酵48 h,产量增加至202mg/L。接着,利用全细胞催化方法对工程菌株BW/pYB-ind1B-sfp-gluton进行谷蓝产量的测试,当外源添加50 mM谷氨酸,10 mM氯化镁、10 mM葡萄糖、50 mM氯化铵在pH 8.0缓冲体系下以20℃催化22 h后,谷蓝产量为5.48 g/L,谷氨酸的转化率为88.5%。谷蓝产量相比于以谷氨酰胺作为底物的工程菌株BW△gln A/pYB-ind1B-sfp增加了162.4%,转化率增加了47.8%。