论文部分内容阅读
本文第一部分实验探究了 Combretastatin A4phosphate(CA4P)与人参皂苷Rd联合用药对HepG2细胞及HepG2异种移植瘤的抑制作用和可能机制。CA4P是一种血管破坏剂,可导致肿瘤血管迅速关闭,进而造成肿瘤中心大面积坏死,从而引起肿瘤缺氧加剧和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的升高。人参皂苷Rd属于人参皂苷的二醇型,对多种肿瘤细胞具有显著的抗增殖作用。最近有文献报道,人参皂苷Rd可以下调HIF-1α的表达并抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,从而在体外和体内抑制MDA-MB-231细胞的生长。因此我们推测,CA4P和人参皂苷Rd的组合可能是一种抗肿瘤的可行思路。本部分实验采用MTT检测了 CA4P和人参皂苷Rd单独或联合使用时对HepG2细胞存活率的影响并分析了两药联合指数;采用TUNEL试剂盒分析了 CA4P和人参皂苷Rd单独或联合使用时对HepG2细胞凋亡的影响;在裸鼠体内建立HepG2异种移植肿瘤模型考察了 CA4P和人参皂苷Rd联合用药在体内的抗肿瘤作用;使用免疫组化检测了肿瘤组织内Ki67的表达情况,使用TUNEL法检测了肿瘤细胞凋亡情况,采用MRI对各组裸鼠肿瘤部位进行成像并分析CA4P和人参皂苷Rd联合用药对肿瘤坏死的影响;采用缺氧探针试剂盒检测了肿瘤中外源性缺氧标记物哌莫硝唑盐酸盐的表达水平,采用Western blot检测了内源性肿瘤标志物HIF-1α蛋白的表达水平;采用Western blot分析了 PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况。结果表明,CA4P和人参皂苷Rd联合用药增强了对HepG2细胞增殖的抑制作用,且两药为协同作用;与单独用药相比,CA4P和人参皂苷Rd联合用药能够增强HepG2细胞凋亡;体内动物实验结果表明,CA4P与人参皂苷Rd联合用药协同抑制了荷瘤裸鼠的肿瘤生长;CA4P与人参皂苷Rd联合用药使肿瘤中Ki67的表达水平显著降低,TUNEL的阳性率显著升高,且肿瘤坏死率提高,表明CA4P与人参皂苷Rd联合用药促进了体内肿瘤细胞的凋亡,抑制了增殖,增加了肿瘤坏死程度;CA4P与人参皂苷Rd联合用药使肿瘤内部缺氧面积减小,并降低了 HIF-1α的表达水平,表明CA4P与人参皂苷Rd的联合用药改善了肿瘤中的低氧微环境;Western blot结果显示,CA4P与人参皂苷Rd联合用药抑制了p-PI3K,p-AKT,p-mTOR和HIF-1α蛋白的表达水平,加入mTOR激活剂MHY1485后,两药联用对于HIF-1α蛋白表达水平的抑制作用减弱,但与模型组相比,仍能显著抑制HIF-1α蛋白的表达。这些结果表明,CA4P和人参皂苷Rd联合用药能有效抑制HepG2细胞增殖并诱导体内外凋亡,其作用机制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制有关。本文第二部分实验构建了一种基于电子转移活化再生催化剂引发的原子转移自由基聚合(AGETATRP)信号放大策略的DNA荧光捕获探针,并考察了这种新方法对于目标DNA的检测能力。对于DNA的灵敏检测有利于提高疾病诊断和风险预测的准确性。采用AGETATRP作为一种新的片上扩增策略用于DNA的荧光检测。首先,目标DNA被硅片上固定的发夹DNA探针捕获。杂交后,通过点击化学将暴露的发夹3’-N3将AGET ATRP引发剂固定到硅片表面上。通过形成荧光素邻丙烯酸酯的长链聚合物将大量的荧光标签与探针的末端连接,继而放大了 DNA检测的荧光信号。在最佳条件下,DNA检测的线性范围为100 fM到1mM,检测限低至4.3fM。此外,该策略在复杂的真实血清样品中显示出良好的检测性能,在1%的胎牛血清样品中,0.1 nM tDNA的荧光强度是Tris-EDTA缓冲液中荧光强度的97.6%。对裸鼠血清中的HER2基因进行定量检测的结果显示,荷瘤裸鼠血清HER2水平较正常组水平升高,证明我们构建的检测方法在真实样本中具有良好的实用性。基于此方法的高灵敏度,低成本和简便性,我们构建的DNA荧光检测方法具有临床转化潜力。