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猪增生性肠炎（Porcine Proliferative Enteritis,PPE）是由胞内劳森菌（Lawsonia Intracellularis,LI）引起的猪接触性传染病,以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞发生根瘤样增生为特征。胞内劳森菌是专性细胞内寄生的革兰氏阴性杆菌,菌体呈弯曲型、逗点型、S型或直的杆状,末端渐细或钝圆,长约1.25～1.75μm,宽约0.25～0.43μm。该菌具有三层波状膜外壁,无纤毛和芽孢。严格细胞内寄生,细胞培养条件为37℃、82.2%氮气、8.8%二氧化碳和6～8%氧气的微需氧环境。LI宿主广泛,主要有猪之外还有马、仓鼠、兔、山羊、鹿、鸵鸟、浣熊、土狼、猕猴和松鼠等。PPE在全世界都有分布,以亚临床症状的为主,大多数感染猪不表现明显的临床症状。本研究拟通过染料法与探针法荧光定量PCR方法筛选到灵敏度高且扩增稳定的引物及探针,在此基础上建立LI Taq Man荧光定量PCR检测方法,并将其运用于猪粪便中的LI病原检测,以期应用于猪场的PPE感染情况调查。1.胞内劳森菌Taq Man荧光定量PCR方法的建立猪肠道的微生物种类繁多、菌群复杂多样,每克肠道内容物中大致有400～500种以上微生物组成,且80%以上的细菌种类被鉴定为未知种类。因此,采用分子生物学方法检测猪肠道内细菌,容易出现假阳性。为找到特异性好、灵敏度高的引物,需设计大量荧光定量引物并筛选。本研究依据Gen Bank中登录号为AM180252的LI全基因组序列,对其中的36个阅读框设计50对荧光定量引物,以LI阳性DNA为模板,通过SYBR Green I荧光定量PCR方法进行扩增筛选;根据结果分析,熔解曲线波峰差异很大,可将50对引物按扩增情况分为3类:（1）无目的片段扩增的引物（13对）;（2）有目的片段扩增,同时有引物二聚体或（及）非特异性片段形成的引物（34对）;（3）有目的片段扩增且无引物二聚体及非特异性片段形成的引物（3对）,分别为LI-0662q PCR-F1/R1、LI-0897q PCR-F1/R1、LI-0352q PCR-F1/R1,该三对引物符合引物特异性筛选标准,用于下一步探针法引物筛选验证。针对上述染料法筛选的引物,合成相应的三条探针以及围绕该探针的27对引物,用Taq Man探针法荧光定量PCR方法分别扩增LI含量高、LI含量低的猪粪DNA两种模板。根据扩增效率的分析,将27对引物进行排序,筛选在两种情况下扩增效率均较优的引物。本研究筛选到以LI0662阅读框为模板设计的一对引物（LI-0662-q PCR-F3/R1）与对应探针（LI-0662-q PCR-P）用于LI荧光定量PCR检测方法的建立。在引物和探针筛选的基础上,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了LI荧光定量PCR检测方法,继而对标准品质粒各稀释度核酸样品进行荧光定量PCR检测,结果显示标准曲线方程为y=-3.4085 lg x+39.671（x:拷贝数,y:Ct值）,相关系数R2为0.9981;Ct值在在模板浓度为2.95×101～2.95×106拷贝/（?）L范围内呈现良好的线性关系;敏感度可达5拷贝/μL;重复性试验显示批内及批间的变异系数（CV）均小于1%。以不同量的回肠炎活疫苗菌分别加入DMEM及阴性粪便中,以本研究建立的方法进行检测,结果显示DMEM加标回收率为85.00～100%;阴性粪便加标回收率为4.27～20.85%。因此本研究建立的LI Taq Man实时荧光定量PCR检测方法可以满足对猪粪便或者组织样本中的胞内劳森菌进行快速、定量、准确且灵敏的检测。2.胞内劳森菌Taq Man荧光定量PCR方法的临床应用江西某猪场部分母猪表现腹泻,精神食欲等正常,收集该猪场4份腹泻粪便样品,进行LI Taq Man荧光定量PCR检测,结果均呈阳性。采用LI1022阅读框的检测引物LI1022-F/R（581bp）对其中3号粪便DNA（Ct值27.33）进行扩增与测序鉴定。测序结果显示该序列为LI序列,且与3条LI序列有同源性:NC-008011.1（100%）、CP004029.1（100%）、EU621794.1（99.82%）。2020～2021年,收集江西省12个猪场的粪便样品383份,应用本研究建立的LI荧光定量PCR检测方法对这383份猪粪便进行LI病原检测,粪便检测结果显示12个猪场中LI阳性猪场共10个（阳性率为83.33%）;383份粪便中LI阳性粪便共109份（阳性率为28.46%）,其中保育猪LI阳性28份（阳性率36.36%）,育肥猪LI阳性4份（阳性率14.29%）,后备猪LI阳性25份（阳性率23.36%）,经产母猪LI阳性率52份（阳性率28.73%）。