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胰蛋白酶(Trypsin,EC 3.4.21.4)和胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin,EC 3.4.21.1)属于丝氨酸蛋白酶家族中的主要水解酶,它们都是肽链内切酶。胰蛋白酶能特异切割赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧链,而胰凝乳蛋白酶可以在酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸(芳香族氨基酸)的羧基处切断肽键。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在鱼体内起着重要的生理和消化功能。工业生产上,在低温下仍然具有高活性的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶可以作为工具酶应用在食品、医药、生物技术等行业。目前,国内外关于鱼类胰蛋白酶的报道很多,但对胰凝乳蛋白酶的报道却很少。本文以淡水日本鳗鲡为研究对象,旨在对其重要消化器官肝胰腺中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶进行同时分离纯化,并对它们的基本酶学性质进行研究,为这类酶的应用提供理论基础。通过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析,Phenyl-Sepharose疏水层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析、SP-Sepharose阳离子交换层析等手段分离纯化得到胰蛋白酶(阴离子型的胰蛋白酶Trypsin B)和胰凝乳蛋白酶(阳离子型的胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin A及阴离子型的胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin B)。SDS-PAGE、Native-PAGE结果表明Trypsin B和Chymotrypsins都得到高度纯化并且都是单体结构。胰蛋白酶B的分子量为21.5 k Da,以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物,胰蛋白酶的最适温度为40?C,最适p H为8.5。动力学实验表明Trypsin B的Km值为3.1μmol/L,kcat值为59.9(S-1),催化效率(kcat/Km)为19.3(μmol/L)-1 S-1。胰凝乳蛋白酶A、B的分子量分别为27 k Da和27.5 k Da,以Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA为底物,胰凝乳蛋白酶A、B的最适温度分别为40和45?C,最适p H值分别为8和8.5,动力学实验表明胰凝乳蛋白酶的Km值分别为9.4和9.1μmol/L,kcat值分别为1.8和4.1(S-1),催化效率(kcat/Km)分别为0.2和0.5(μmol/L)-1 S-1。所纯化的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在酸性条件下均不稳定,而在碱性条件下稳定,二价金属离子Cu2+,Zn2+和Fe2+能明显的抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活力。另外,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、benzamidine、和STI等对所纯化的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶起到很强的抑制作用。胰蛋白酶B的N-末端12个氨基酸序列为IVGGYECEPHSQ,该序列和来自其它物种的胰蛋白酶的序列有很高同源性。免疫印迹实验表明,鳗鲡胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均能与兔抗鲫鱼胰蛋白酶多克隆抗体、兔抗鲫鱼胰凝乳蛋白酶多克隆抗体呈不同程度的阳性反应。所纯化的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对南美白对虾的肌原纤维有分解作用。