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目的本研究以透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为载体骨架,分别构建pH敏感的透明质酸-阿霉素-三苯基膦(HA-hydra-DOX-TPP)纳米给药系统用以实现阿霉素(doxorubicin,DOX)的线粒体靶向递送、以及谷胱甘肽响应的非病毒基因载体N,N,N-三甲基胱胺修饰的透明质酸-精胺-阿霉素-三苯基膦(HSTC),用以共载线粒体靶向药物和siRNA,以提高DOX抗肿瘤活性,克服肿瘤耐药,降低全身毒副作用。方法1.合成线粒体靶向药物阿霉素-三苯基膦(DOX-TPP),并将DOX-TPP通过腙键接枝到HA上制备成HA-hydra-DOX-TPP纳米制剂。此外,构建N,N,N-三甲基胱胺修饰的HSTC非病毒基因载体,通过核磁共振、红外光谱和液相质谱对产物进行结构鉴定,并对HA-hydra-DOX-TPP和HSTC/siRNA复合物的粒径和电镜进行考察;2.采用MTT法评价HA-hydra-DOX-TPP和HSTC/siRNA复合物的体外细胞毒性,通过共聚焦显微镜观察DOX-TPP、HA-hydra-DOX-TPP和HSTC/siRNA复合物在细胞内的分布及药物释放。流式细胞术评价HA-hydra-DOX-TPP 对 MCF-7/ADR 细胞内线粒体膜电位、活性氧(reactive oxygen species,ROS)产量、Caspase3活性的影响和细胞凋亡情况,以及考察HSTC/siRNA复合物的细胞摄取情况;3.利用琼脂糖凝胶电泳考察HSTC携载siRNA的能力,确定载体与siRNA的结合比例。同时,考察不同浓度的二硫苏糖醇(DTT)对siRNA释放的影响。通过实时荧光定量PCR法和蛋白免疫印迹实验测定HSTC/siTwist复合物对肿瘤细胞内Twist mRNA生成的抑制作用;4.建立MCF-7/ADR荷瘤裸鼠模型,共聚焦显微镜观察肿瘤组织中药物的累积。采用免疫组化染色法考察HA-hydra-DOX-TPP引起肿瘤组织中细胞色素C产量变化,通过TUNEL实验考察引起肿瘤组织中细胞凋亡的情况。采用H&E染色法观察心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤的组织形态,评价HA-hydra-DOX-TPP的体内安全性。结果通过核磁共振、红外光谱和液相质谱检测,DOX和TPP成功通过酰胺键结合形成DOX-TPP,共聚焦显微镜观察发现其具有良好的线粒体靶向功能,DOX-TPP的肿瘤细胞毒性明显高于DOX。进一步将其与透明质酸结合,得到HA-hydra-DOX-TPP纳米制剂,经测定粒径为192nm,电位为-24mV,形态为球形纳米粒子,且具有较好的分散性。HA-hydra-DOX-TPP的体外释药具有pH依赖性,在pH5.0的缓冲液中,DOX-TPP可以快速释放。共聚焦显微镜下观察发现HA-hydra-DOX-TPP释放出的DOX-TP]P最终靶向到线粒体。相对于DOX,纳米制剂HA-hydra-DOX-TPP可以增加细胞对药物的摄取,增强细胞内Caspase 3的活性,诱导产生较多的ROS,从而表现出较大的细胞毒性。体内抗肿瘤活性结果表明,HA-hydra-DOX-TPP可以提高肿瘤组织的药物累积量,导致肿瘤细胞产生较多的细胞色素C,更显著的诱导肿瘤细胞凋亡。并且没有对心脏、肝脏、脾、肺、肾脏等正常组织器官产生明显的毒性,显示了较高的安全性。经核磁共振和液相质谱检测,合成了 N,N,N-三甲基胱胺修饰的非病毒基因载体HSTC,琼脂糖凝胶实验表明当HSTC与siRNA的质量比为100:1时,可以完全阻滞siRNA,在这个比例下制得HSTC/siRNA复合物粒径为80nm,电位为17mV,具有规则的形态。HSTC/siRNA复合物具有谷胱甘肽响应性释放siRNA的功能,且肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽有利于siRNA的释放。胞内转运及溶酶体逃逸的研究表明,其可以成功从溶酶体中逃逸,释放出的药物DOX-TPP能够靶向到线粒体,并且在细胞质中释放siRNA。HSTC/siRNA复合物可以提高细胞对siRNA的摄取,抑制肿瘤细胞内TwistmRNA的表达。结论本研究成功构建了 pH敏感的HA-hydra-DOX-TPP纳米给药系统,可将DOX运送至线粒体,提高了肿瘤组织的累积,增强了 DOX的抗肿瘤活性。同时构建谷胱甘肽刺激响应的非病毒基因载体HSTC共载siTwist和线粒体靶向药物,有效抑制Twist mRNA的表达。