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研究背景及目的肝脏在胆酸合成、分泌及胆汁形成中起到重要作用。肝细胞是一种高度极性化的上皮细胞,包括基底侧膜和顶端膜。在肝细胞的基侧膜和顶端膜上有多种特异性的转运蛋白,包括多耐药相关蛋白(multidrug resistance-assocated proteins,MRPs)、MDR2、BSEP、NTCP和OATPs等。多耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)和多耐药相关蛋白3(multidrug resistance-associated protein 3,MRP3)均属于MRPs家族,是ABC转运体蛋白亚家族的一个分支。在肝脏中,MRP2定位于肝细胞的顶端膜(毛细胆管面),而MRP3则定位于肝细胞的基底侧膜。MRP2可转运多种有机阴离子,包括葡萄糖醛酸结合物(结合型胆红素)﹑还原型谷光苷肽﹑硫酸盐和某些化疗药物。MRP3与MRP2具有底物同源性,主要运载葡萄糖醛酸酯、单价胆盐和硫酸胆盐。MRP2在Dubin–Johnson综合征患者肝细胞膜上的表达明显下降或缺失,患者主要表现为结合型高胆红素血症。LPS诱导的大鼠胆汁淤积可下调Mrp2蛋白在肝细胞膜上的表达。MRP3在正常肝细胞低表达或不表达,但在实验性大鼠胆汁淤积模型、梗阻性黄疸和Dubin–Johnson综合征患者肝脏中表达明显增高。一些治疗胆汁淤积的药物可诱导MRP2和MRP3表达上调从而促进胆汁分泌,阻止疏水性胆汁酸诱导胆汁淤积,如目前广泛使用的熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)。肝细胞膜转运蛋白MRP2和MRP3在肝脏物质转运中具有重要作用,其调节的相关机制已受到越来越多的关注。研究发现多种核受体参与了MRP2和MRP3基因转录水平的调节。组成性雄烷受体(constitutive androstane receptor, CAR)和孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)是NR1I核受体家族的两个重要成员。它们是内源性代谢产物及外源化学物质的感受器,通过对肝脏膜转运蛋白的调节而发挥毒性物质的清除作用。研究发现PXR、CAR均可诱导体外培养的小鼠肝细胞MRP2基因表达上调,对MRP3基因表达也有一定调节作用。目前用于治疗胆汁淤积的药物苯巴比妥是PXR和CAR共同的配体。此外,用于治疗黄疸的传统中药茵栀黄,已鉴定为CAR的配体。他们可以通过激动PXR和/或CAR上调肝细胞膜转运蛋白而发挥治疗胆汁淤积的作用。因此CAR和PXR特异性激动剂将有可能成为胆汁淤积治疗药物的有效靶点。中药藏茵陈,具有利胆护肝的作用,长期以来用于治疗胆汁淤积有显著效果。龙胆苦苷和芒果苷是藏茵陈的两种单体成分,它们是否能改变肝细胞膜转运蛋白的表达从而为研究其治疗胆汁淤积作用提供依据是我们所关注的问题。实验通过用龙胆苦苷和芒果苷体外刺激HepG2细胞,以及在体内处理正常大鼠,观察这两种单体对肝细胞膜转运蛋白MRP2/Mrp2和MRP3/Mrp3表达的影响,并观察核受体PXR、CAR表达的变化,旨在为探索新的胆汁淤积临床治疗方法提供理论支持。研究方法1.龙胆苦苷、芒果苷体外刺激HepG2细胞,以UDCA为阳性对照组,DMSO为阴性对照组。MTT实验检测药物对细胞生长的影响;RT-PCR检测药物对HepG2细胞膜转运蛋白MRP2、MRP3及其相关核受体PXR、CAR基因mRNA表达的影响;Western blot检测药物对HepG2细胞膜转运蛋白MRP2、MRP3及其相关核受体PXR、CAR蛋白表达的影响2.龙胆苦苷(100mg/kg)、芒果苷(100mg/kg)处理正常大鼠7天,UDCA(90mg/kg)为阳性对照组,生理盐水为阴性对照组。检测药物对胆汁流量的影响;免疫组化检测Mrp2、Mrp3蛋白在大鼠肝细胞膜的定位表达;RT-PCR检测Mrp2、Mrp3基因PXR、CAR mRNA水平的变化;Western blot检测大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp2、Mrp3及核受体PXR、CAR蛋白水平的变化。结果1.MTT实验结果表明:龙胆苦苷和芒果苷在5uM到100uM浓度范围内对HepG2细胞生长无抑制作用影响,随时间变化表现为促进细胞增殖。说明药物在该浓度范围对HepG2细胞没有毒性作用。2.RT-PCR检测发现:与阴性对照组相比,龙胆苦苷、芒果苷均可显著上调HepG2细胞膜转运蛋白MRP2、MRP3mRNA及其相关核受体PXR、CAR mRNA表达( p<0.05)。3.大鼠体内实验发现:与阴性对照组相比,龙胆苦苷、芒果苷可显著增加大鼠胆汁流量,差异具有统计学意义,P<0.01。4.Western blot检测发现:与阴性对照组相比,龙胆苦苷、芒果苷均可上调HepG2细胞膜转运蛋白MRP2、MRP3及其相关核受体PXR、CAR蛋白表达( p<0.05)。其中芒果苷对MRP3上调作用强于UDCA(P<0.05)。5.免疫组化结果显示:与阴性对照组相比,龙胆苦苷处理组的大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp2、Mrp3蛋白表达均增高,芒果苷处理的大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp2表达明显增高,但Mrp3表达无变化。6.RT-PCR检测显示与阴性对照组相比,龙胆苦苷、芒果苷均可上调大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp2、Mrp3及其相关核受体PXR、CAR mRNA表达(P<0.05)。7.western blot检测显示:与阴性对照组相比,龙胆苦苷可显著上调大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp2、Mrp3及核受体CAR蛋白表达水平;且龙胆苦苷对大鼠Mrp2和Mrp3上调作用强于UDCA(P<0.05)。芒果苷对大鼠肝细胞膜转运蛋白Mrp2及核受体CAR表达有上调作用(P<0.05),但对大鼠Mrp3蛋白表达无明显改变。与阴性对照组相比,芒果苷、龙胆苦苷组PXR蛋白表达水平无明显差异,(p>0.05)。结论本研究结果发现,龙胆苦苷可上调肝细胞膜转运蛋白MRP2、MRP3 mRNA及蛋白表达水平;芒果苷可上调MRP2 mRNA及蛋白表达水平,对MRP3蛋白的调节具有体内外差异。在体内外实验中龙胆苦苷和芒果苷均可上调核受体CAR mRNA及蛋白表达,推测核受体CAR更有可能在龙胆苦苷、芒果苷对MRP2和/或MRP3表达的调节中起到重要作用。此外,龙胆苦苷(100mg/kg)和芒果苷(100mg/kg)均可显著增加大鼠胆汁流量,提示其可能对大鼠胆汁分泌起到促进作用。同时龙胆苦苷和芒果苷的安全性和有效性还值得进一步研究。