促性腺激素释放激素(Gn RH)通过下丘脑-垂体-性腺轴(HPG axis)紧密调控动物的生殖功能和行为,是动物生殖生理的中枢启动激素和调控激素;同时,生殖内分泌与生长内分泌、免疫系统功能及动物肉品质特别是公猪肉“膻味”形成密切相关。Gn RH主动免疫通过有效“中和”内源性Gn RH,抑制性激素的分泌和配子的发生,从而达到免疫去势目的,已成为目前最有望取代传统外科阉割去势的安全友好的去势方法。然而,目前Gn RH主动免疫去势仍然存在不少问题,严重阻碍了Gn RH主动免疫去势实践应用:1)少数动物Gn RH主动免疫后反应较小或没有反应,存在免疫“逃逸”现象;2)为了达到良好的免疫去势效果,存在Gn RH去势疫苗抗原用量大且需2次或2次以上注射,提高了Gn RH主动免疫去势的应用成本;3)Gn RH主动免疫去势的分子机制不清楚,严重阻碍了上述两个问题的解决;4)Gn RH主动免疫扰乱生殖内分泌后对动物生长内分泌、免疫系统及公猪肉“膻味”物质代谢的影响及其可能作用机制不完全清楚。因此,本研究通过五个试验,以SD雄鼠、雄性绵羊和公猪为试验对象,研究Gn RH新蛋白构型抗原制备策略并系统探讨Gn RH主动免疫对生殖内分泌、生长内分泌、免疫系统及功能、公猪肉“膻味”物质(雄烯酮和粪臭素)代谢的影响及其作用机制,为研发高效Gn RH免疫去势疫苗及推动Gn RH主动免疫去势大规模实践应用提供理论参考。试验一新蛋白构型Gn RH去势抗原设计及不同新蛋白构型Gn RH去势抗原免疫学及生物学效果对比研究本研究中新蛋白构型Gn RH抗原设计的核心思路是:1)增加Gn RH拷贝数;2)增大抗原分子量。新蛋白构型Gn RH抗原设计如下:以D型赖氨酸(D-lysine)取代天然Gn RH十肽第6位甘氨酸(Glysine)形成与载体蛋白偶连位点(G6K-Gn RH,G6K),以化学合成法合成G6K-Gn RH并列体(G6K-Gn RH-tandem,G6KT)作为新蛋白Gn RH抗原制备的基本单元。将G6KT二聚化,形成本研究抗原○1G6KTD,紧接着将G6KT和G6KTD分别与卵清蛋白(OVA)偶联分别形成本研究抗原○2G6KT-OVA及○3G6KTD-OVA。将3种新蛋白构型Gn RH抗原配于Specol佐剂分别免疫SD雄鼠,6周龄时初免,腿部肌肉注射1ml乳化抗原(含相应新构型Gn RH蛋白100μg),8周后加免,注射剂量与方法同初次免疫,同时设置完整对照组(Intact controls)和手术去势组(Surgical castrates),每试验组12只雄鼠。免疫当天及免疫后4、8、12 wpv(weeks post vaccination)尾动脉采集血液分析血清Gn RH抗体滴度和生殖激素浓度变化,加免后4周断颈处死所有试验鼠,采集垂体及两侧睾丸,q PCR检测生殖相关基因m RNA表达并进行睾丸组织学分析。试验结果显示:1)三种新蛋白构型Gn RH抗原主动免疫后均能刺激雄鼠产生良好的抗体反应(P<0.05)。2)其中G6KT-OVA及G6KTD-OVA免疫组仅初免就能诱发较高水平的抗体产生,初免4周后就显著降低雄鼠体内血清LH、FSH、睾酮及抑制素B浓度(P<0.05);在试验结束时,两免疫组睾丸重量及体积均下降到完整对照组睾丸50%以下,精子发生完全被终止,垂体Gn RHR、LHβ、FSHβ及睾丸LHR、FSHR、INHα,INβA及INHβB m RNA表达显著下调(P<0.05);3)G6KTD免疫组12只雄鼠中,9只(75%)有显著的免疫学和生物学反应(“免疫反应鼠”),而剩余3只(25%)则无明显的生物学反应(“免疫逃逸鼠”);“免疫反应鼠”,G6KTD初免对所测血清生殖激素浓度无明显影响(P>0.05),但加免后显著降低血清LH、FSH、睾酮及抑制素B浓度(P<0.05);处死时其睾丸重量和体积分别减少到完整对照睾丸的64%和62%,且睾丸精子发生受到明显抑制,同时垂体和睾丸所测生殖相关基因m RNA表达水平显著下调(P<0.05);而“免疫逃逸鼠”则整个试验期间血清生殖激素浓度与完整对照组雄鼠相似(P>0.05),处死时睾丸精子发生正常,垂体和睾丸所测生殖相关基因m RNA表达水平与完整对照组相似(P>0.05)。因此,新蛋白构型G6KT-OVA和G6KTD-OVA具有极强的免疫原性,初次免疫就能达到抑制生殖轴生殖激素分泌的目的,在作为单剂量Gn RH疫苗方面具良好的开发前景;同时G6KTD也具有较强的免疫原先,可单独作为Gn RH去势抗原,能有效避开Gn RH分子与载体蛋白偶连所面临的Gn RH抗原损失严重及与载体蛋白偶连的后续纯化等问题。试验二Gn RH主动免疫对动物下丘脑-垂体-睾丸轴功能的影响本研究为了提高研究结论的可靠性(即,避开物种差异对探讨Gn RH主动免疫去势机理的干扰),我们同时研究了Gn RH主动免疫对SD雄鼠、雄性绵羊和公猪下丘脑-垂体-睾丸轴功能的影响。SD雄鼠、雄性绵羊和公猪均分为:Gn RH免疫去势组、完整对照组和手术去势组。免疫去势组SD雄鼠主动免疫G6KT-OVA,雄性绵羊和公猪主动免疫G6KTD-OVA,加免一次,间隔8周,加免后4-8周处死试验动物,分离下丘脑、垂体及睾丸q PCR分析生殖轴生殖相关基因m RNA表达变化,试验期间采集血液分析血清Gn RH抗体和生殖激素浓度变化。结果显示:1)在SD大鼠、雄性绵羊及公猪上我们均发现,Gn RH主动免疫后随着血清Gn RH抗体滴度的升高,血清生殖激素LH、FSH、睾酮及抑制素(精子发生的biomarker)浓度缓慢降低,加免后随血清Gn RH抗体急速上升到一定浓度时,血清生殖激素降低到极低甚至不可测水平,睾丸萎缩、精子发生受到抑制或完全终止,表明在Gn RH主动免疫初期,抗体“中和”理论完全能解释Gn RH主动免疫去势的机制;2)与完整对照组相比,Gn RH主动免疫显著下调下丘脑弓状核(Arc)及前腹侧室旁核(AVPV)AR、kiss1、GPR54及Gn RH m RNA表达水平和下丘脑正中隆起Gn RH含量(P<0.05),表明Gn RH主动免疫通过下调下丘脑AR-kiss1-GPR54-Gn RH信号通路,显著降低下丘脑Gn RH合成和或释放;动物手术去势后也得到和Gn RH去势后一致的研究结果,表明下丘脑Gn RH上游信号环路完整性和Gn RH正常合成需要睾丸类固醇激素的维持。上述研究结果在SD大鼠、雄性绵羊和公猪上一致,由此说明,Gn RH主动免疫后下丘脑Gn RH的合成和释放的降低是造成Gn RH主动免疫去势的重要原因之一,特别是在Gn RH抗体滴度降低后Gn RH免疫动物仍然维持不育的重要原因;3)Gn RH主动免疫显著降低(P<0.05)垂体Gn RH基因受体Gn RHR m RNA表达水平及睾丸LHR、FSHR m RNA表达水平且在三种受试动物上研究结果一致。垂体Gn RHR及睾丸LHR和FSHR表达降低,严重破坏生殖轴功能的完整性,这也是Gn RH主动免疫去势的重要原因之一,特别是维持较长时间去势状态的重要原因之一。试验三GnRH主动免疫对GHRH/SS-GH-IGF1轴功能的影响本项研究在试验二SD雄鼠和目标动物公猪上进行,动物分组处理见试验二。试验开始后每隔4周采集血清以分析血清生长相关激素浓度变化;记录试验动物每天采食量,并在初免当天、加免当天及试验最后一天称取动物体重,计算各处理组动物从初免到加免、加免到试验结束及整个试验期间的日增重及饲料转化效率;试验结束时采集动物下丘脑、垂体及肝脏q PCR分析生长相关基因m RNA表达水平。试验结果显示,与完整对照组相比,手术去势显著降低雄鼠和公猪下丘脑(P<0.05)Gn IH、GHRH,垂体GH和肝脏IGF1 m RNA表达;显著降低血清(P<0.05)GH和IGF1浓度;显著增加(P<0.05)血清尿素氮含量。与手术去势不同,Gn RH主动免疫对SD雄鼠和公猪下丘脑Gn IH、GHRH,垂体GH和肝脏IGF1 m RNA表达和血清GH浓度无影响(P>0.05);此外Gn RH免疫去势动物血清IGF1和尿素氮含量分别显著高于和低于(P>0.05)手术去势动物血清相应含量;与手术去势动物相比,Gn RH免疫去势SD雄鼠和公猪有更高的饲料转化效率(P<0.05)。由此可知,免疫去势动物较手术去势动物具有更优异的生产性能表现,这主要是由于免疫去势对GHRH-GH无明显影响所致。Gn IH作为同时能调节生殖内分泌及生长内分泌的因子,很可能是生殖内分泌与生长内分泌间的桥梁分子,是造成手术去势与免疫去势后下丘脑GHRH表达差异的原因。试验四Gn RH主动免疫对免疫系统功能的影响本研究在试验三雄性绵羊中开展。试验期间按试验三中所述采集血清分析血清免疫细胞因子浓度,试验结束采集脾脏q PCR分析生殖和免疫相关基因m RNA表达变化。结果显示,与完整对照组相比,Gn RH主动免疫显著增加(P<0.05)脾脏Gn RH m RNA和蛋白含量;与脾脏Gn RH表达上调一致,Gn RH主动免疫显著上调(P<0.05)脾脏IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α及淋巴细胞表面分子CD4、CD8、CD19 m RNA表达水平以及血清IL-2、IL-4,IL-6、TNF-α浓度。与免疫去势相似,手术去势也显著上调(P<0.05)绵羊脾脏Gn RH及免疫细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-αm RNA表达及血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α浓度。此外,Gn RH主动免疫和手术去势均显著下调(P<0.05)脾脏AR m RNA表达,表明免疫或手术去势后脾脏Gn RH表达增加可能是因两种去势处理解除了雄激素对脾脏Gn RH合成的反馈抑制所致。由上推断,Gn RH主动免疫通过解除睾酮对脾脏Gn RH合成的反馈抑制作用,继而上调脾脏Gn RH表达,从而显著增强动物免疫功能。试验五Gn RH主动免疫对公猪“boar taint”及“boar taint”代谢的影响本研究在试验二公猪试验上进行。试验开始后,按试验二中所述采集血液分析血液生殖激素和公猪“boar taint”物质浓度变化;试验结束时采集背部脂肪分析脂肪“boar taint”物质含量,采集肝脏及睾丸分析“boar taint”物质代谢相关基因m RNA表达和蛋白水平变化。结果显示,与完整对照相比,Gn RH主动免疫显著下调(P<0.05)睾丸雄烯酮合成关键酶STAR、CYP11A1、CYP17A1及CYB5A m RNA表达;显著降低(P<0.05)血清和脂肪雄烯酮水平,表明Gn RH主动免疫能有效抑制睾丸雄烯酮的合成,这是Gn RH主动免疫去除公猪体内雄烯酮沉积最主要原因。此外,Gn RH主动免疫显著上调(P<0.05)肝脏雄烯酮代谢降解酶3β-HSD及SULT2A1 m RNA和蛋白质表达,与手术去势后研究结果一致,表明睾丸性激素对肝脏雄烯酮代谢酶的表达或活性具有抑制作用,Gn RH主动免疫也可通过抑制睾丸性激素的产生继而增强肝脏雄烯酮清除能力。Gn RH主动免疫显著降低(P<0.05)公猪血清和脂肪粪臭素含量,屠宰时免疫去势公猪血清和脂肪粪臭素含量下降到手术去势公猪水平。与血清和脂肪粪臭素水平降低一致,Gn RH主动免疫和手术去势均显著上调(P<0.05)肝脏粪臭素代谢关键酶CYP2E1、CYP2A19、CYP2C49及CYB5A m RNA表达,表明睾丸类固醇激素对肝脏粪臭素代谢也有显著的抑制作用。相关分析显示,相对于血清睾酮及雌二醇,雄烯酮和血清粪臭素含量呈现更加显著的正相关关系(P<0.05),表明雄烯酮是肝脏粪臭素代谢的主要抑制因子。由此可知,Gn RH主动免疫能有效清除公猪体内由雄烯酮和粪臭素沉积所引起的“膻味”。其中,睾丸合成雄烯酮的强度似乎是决定公猪脂肪中沉积雄烯酮和粪臭素含量多少的主要决定因素。