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目前,缺血性心血管疾病的发病率和致死率逐年上升,严重危害人类健康。其发病制十分复杂,其中内皮细胞功能障碍是导致缺血性心血管病的重要环节。虽然成熟内皮细胞能够修复损伤内皮,但是其再生能力有限。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类血管内皮细胞的前体细胞,具有向内皮细胞分化的潜能。大量研究表明,EPCs在血管修复和新生中发挥多种作用。但是,目前EPCs移植在临床应用仍面临诸多问题,多种心血管疾病或心血管疾病危险因素诸如老龄、高血压、高胆固醇血症、糖尿病等会减少循环EPCs数目,并损害EPCs的功能,这很大程度上限制了EPCs在缺血性心血管疾病中的应用。因此,改善EPCs功能将是未来EPCs移植治疗的重要策略。胸腺素P4 (thymosin β4, Tβ4),是一种由43个氨基酸残基组成的小分子量蛋白,它介导了多种生物学反应,如血管新生、创伤愈合、炎症控制等。我们此前的研究发现Tβ4能够增强人外周血EPCs的增殖、迁移,并抑制人外周血EPCs的凋亡和衰老,但是Tβ4对于循环EPCs的成血管功能、旁分泌功能以及Tβ4预处理EPCs后进行移植是否能进一步提高EPCs移植治疗的疗效目前尚不明确。基于上述考虑,我们首先观察了体外实验中Tβ4对EPCs成血管功能的影响及相关机制；其次我们研究了Tβ4对EPCs旁分泌的作用；最后我们进行了动物实验探究了Tβ4预处理EPCs后进行移植是否能进一步提高EPCs移植治疗的疗效。以下分三部分对本研究的方法、结果及结论分别简述。1胸腺素β4对循环内皮祖细胞成血管功能的影响目的：观察Tβ4体外干预对外周血内皮祖细胞成血管功能的影响及相关机制方法：采用密度梯度离心法从人外周血获取单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白(HFN)包被的培养板,培养7d后,收集贴壁细胞,采用FITC-UEA-I和DiI-acLDL染色,在激光共聚焦显微镜下观察,双染阳性细胞鉴定为正在分化的EPCs。加入不同浓度的Tβ4 (10ng/mL, 100ng/mL和1000ng/mL)干预,采用Matrigel胶体外成血管能力测定实验观察EPCs的成血管能力。Western blot检测EPCs Akt Ser473和eNOS Ser1177的磷酸化水平。随后,在分别加入Akt siRNA 及 eNOS siRNA干扰后,再予1000ng/mL Tβ4干预,再次采用Matrigel胶体外成血管能力测定实验观察不同实验组EPCs的成血管能力。结果：Tβ4能明显增加EPCs的成血管能力,并呈一定的量效关系,在1000ng/mL达到最大效应(与对照组比较,33.33±1.86 vs 18.34±2.02,P<0.05)。Western blot检测显示Tβ4能促进Akt Ser473及eNOS Ser1177的磷酸化,且呈一定的量效关系。Akt siRNA及eNOS siRNA均显著抑制了Tβ4促进EPCs成血管的作用。结论：Tβ4可增强EPCs的体外成血管功能,且呈一定的量效关系。Akt/eNOS信号转导途径参与对Tβ4促进EPCs体外成血管能力的调控。2胸腺素β4对循环内皮祖细胞旁分泌作用的研究目的：观察Tβ4影响外周血内皮祖细胞旁分泌功能的影响及相关机制方法：分离和获取外周血内皮祖细胞(EPCs)方法同前。加入不同浓度的Tβ4(10ng/mL, 100ng/mL和1000ng/mL)干预,采用荧光定量PCR检测EPCs内VEGF和IL-8的表达,采用ELISA试剂盒检测EPCs条件培养基(EPCs-derived conditioned medium,EPCs-CM)中VEGF和IL-8的表达。采用Transwell细胞迁移检测和Matrigel胶毛细血管样结构形成分别检测EPCs-CM、Tβ4-EPCs-CM及Tβ4-EPCs-CM加入中和性抗体(VEGF和IL-8中和性抗体)干预之后人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)体外迁移和成血管能力。在分别加入Akt siRNA及eNOS siRNA干扰后,再予1000ng/mL Tβ4干预,采用ELISA试剂盒检测EPCs-CM中VEGF和IL-8的表达。结果： Tβ4干预能明显增加EPCs内和EPCs-CM中VEGF和IL-8的表达,EPCs-CM能够显著增加内皮细胞迁移和成血管作用,Tβ4干预能进一步增强EPCs-CM对内皮功能的影响,而VEGF和IL-8的中和性抗体可以分别拮抗T04对EPCs-CM促内皮迁移和成血管的增强效应。Akt siRNA可以显著降低Tβ4-EPCs-CM中VEGF和IL-8的表达；eNOS siRNA可以显著降低Tβ4-EPCs-CM中、VEGF而非IL-8的表达。结论：Tβ4能够促进EPCs的旁分泌作用,增加1EPCs内和EPCs-CM中VEGF和IL-8的表达,且这一作用与Akt/eNOS信号转导途径有关。3胸腺素β4对循环内皮祖细胞移植作用的影响目的：观察Tβ4对外周血内皮祖细胞移植作用的影响方法：分离和获取外周血内皮祖细胞(EPCs)方法同前。采用前降支结扎法建立大鼠心肌梗死模型,按不同分组分别将150μL培养基、1×106个EPCs及相同数量的经Tβ4预处理24小时后的EPCs采用心肌注射的方法移植于心脏缺血区。心梗4周后采用超声心动图检测大鼠的心脏功能,组织切片免疫荧光检测心梗缺血边缘区血管密度及移植EPCs驻留和参与血管修复情况；组织切片免疫组化及组织蛋白电泳检测缺血区VEGF的表达及组织纤维化的程度。结果：Tβ4预处理能明显提高EPCs在体驻留,并参与血管的修复,较单纯EPCs移植进一步增加了缺血区血管密度,减低纤维化程度,最终改善大鼠心梗4周后的心脏功能。结论：Tβ4能明显提高EPCs的移植效果,增加缺血区血管密度,降低纤维化程度,改善心功能。