背景:皮肤一旦损伤,将形成创面并失去其保护机制。一方面,创面脱水将可能难以为创面愈合提供理想的湿润环境,过度的水分丧失也可导致机体内环境稳态受到破坏;另一方面,微生物将易于侵入而导致严重感染,阻碍创面愈合过程,甚至威胁机体的生命。如何迅速地封闭与保护创面以及有效地控制创面细菌感染是皮肤创面修复领域的重要课题。大面积深度创面以及慢性创面无法快速自然愈合,因此使用作为临时性皮肤替代物的创面敷料封闭保护创面、促进创面愈合是非常必要的。然而,现有的临床敷料产品存在着功能单一、浸渍创面、价格昂贵等缺陷与不足。因此,制备一种理想的、多功能的创面敷料仍然是我们面临的巨大挑战。石墨烯是一种以六个碳原子围成的六边形晶格为单元组成的仅有一层原子厚度的二维晶体,它具有特殊的二维结构、巨大的比表面积、突出的机械刚度、极高的光热转换效率、良好的生物相容性、较强的抗菌活性等理化与生物学性能。硅橡胶是一种常用的高分子材料,由于其相对低廉的价格、突出的柔韧性、较高的气体通透性、良好的生物相容性,可能用作一种理想的创面敷料基底材料。如果将石墨烯与硅橡胶进行复合,是否两者之间可以性能互补,成为一种新型多功能复合材料,能否将该复合材料用作创面敷料以促进创面愈合,目前并无相关研究报道。因此,我们在第一部分研究中努力研制了一种石墨烯-硅橡胶复合材料,并通过体内外实验系统性地探究了前述问题,证实其确实可用作一种较理想的新型多功能创面敷料。同时,由于石墨烯自身的抗菌效应常常受到诸多因素（如浓度、大小、片层数、细菌种类、环境等）的制约,我们也发现该石墨烯-硅橡胶敷料体内抗菌效果并不完全令人满意,在感染创面上的应用受到一定限制。感染是影响皮肤创面修复的另一重要因素。针对皮肤创面细菌感染,临床上仍然主要依赖于抗生素治疗,但抗生素治疗常常伴随着多重耐药菌株的出现与流行。目前,由于缺乏新的抗生素,一些泛耐药的菌株甚至出现“无药可治”的状况。因此,我们试图继续以石墨烯为突破口,从生物材料与纳米医学的角度来寻找皮肤创面/皮下组织细菌感染的治疗新策略。石墨烯是一种良好的光热剂,基于石墨烯的光热抗菌治疗已成为近年的研究热点。然而,目前基于石墨烯的光热抗菌剂仍然存在着一些缺陷与不足。最大缺陷在于其对细菌无特定靶向性,在光热消融细菌的同时,难以避免周围正常组织的热损伤。因此,在第二部分研究中,我们利用氨基与羧基的缩合反应,将靶向分子乙二醇化壳聚糖与基底材料羧基化石墨烯共价结合,制备了一种新型靶向抗菌纳米材料—石墨烯-壳聚糖。它在酸性条件下,因壳聚糖骨架上的大量氨基质子化而迅速发生表面电荷反转,进而通过静电作用与表面带负荷的细菌紧密结合,直接对细菌进行靶向光热消融,有效控制小鼠皮下MRSA感染,促进感染创面的快速愈合。该部分研究着重解决了光热材料的细菌靶向性问题,进一步拓展了石墨烯在皮肤创面修复领域中的应用。目的:本研究拟制备出两种基于石墨烯的新型复合材料（石墨烯-硅橡胶和石墨烯-壳聚糖）,为拓展石墨烯在皮肤创面修复领域中的应用提供新的思路和实验基础,也为临床皮肤创面疾病的治疗提供新的手段。第二章新型石墨烯-硅橡胶敷料的研制及其促进皮肤创面修复的研究方法:1.通过“三步法”制备石墨烯-硅橡胶多孔薄膜;2.扫描电镜观察石墨烯气凝胶微球及石墨烯-硅橡胶混合物的形貌;3.顶空气相色谱法测定石墨烯-硅橡胶多孔薄膜中的有机物残留量;4.透射电镜、原子力显微镜观察石墨烯的形貌;透射电镜观察石墨烯-硅橡胶多孔薄膜中石墨烯的分散情况;5.扫描电镜、超景深数字显微镜观察石墨烯-硅橡胶多孔薄膜的孔径结构;6.石墨烯-硅橡胶多孔薄膜的力学性能测试;7.石墨烯-硅橡胶多孔薄膜的水蒸气透过率检测;8.CCK-8法检测石墨烯-硅橡胶多孔薄膜的细胞相容性;9.扫描电镜观察石墨烯与细菌的相互作用,荧光探针标记检测细菌细胞内的活性氧水平;10.标准平板计数法检测石墨烯-硅橡胶多孔薄膜的体外抗菌性;11.制作小鼠全层皮肤缺损创面模型,将石墨烯-硅橡胶多孔薄膜用作创面敷料,观察创面的大体愈合情况,制备创面组织病理切片,进行HE染色,利用Image pro plus6.0软件测量创面面积、新生上皮长度及肉芽组织厚度,计算创面愈合率、创面愈合时间。结果:1.石墨烯气凝胶微球呈一种中心发散、多通道的“蒲公英”样结构;在负压下,液态硅橡胶可被吸入石墨烯气凝胶微球中;经超声振荡,石墨烯气凝胶微球可碎片化,石墨烯均匀地分散于硅橡胶中;2.成功制备了含不同浓度（0、0.1、0.2、0.5 wt%）石墨烯的石墨烯-硅橡胶多孔薄膜;3.石墨烯-硅橡胶多孔薄膜中四氢呋喃、正己烷的平均残留量分别为2 ppm、0.6ppm;4.石墨烯-硅橡胶薄膜上下表面均呈多孔结构;石墨烯（0、0.1、0.2、0.5 wt%）-硅橡胶薄膜上表面的孔径分别为18.64±2.67μm、17.52±2.75μm、15.57±1.87μm、14.94±2.35μm,其下表面的孔径分别为77.95±9.83μm、72.97±8.92μm、68.37±6.33μm、60.67±9.09μm,上表面孔径明显小于下表面孔径;5.石墨烯的引入可显著提升硅橡胶薄膜的拉伸强度和杨氏模量;6.石墨烯（0、0.1、0.2、0.5 wt%）-硅橡胶多孔薄膜的水蒸气透过率分别为119±2 g/m²/24 h、122±1 g/m²/24 h、124±2 g/m²/24、137±2 g/m²/24 h;7.在细胞接种后第1、3、5、7天,三种石墨烯（0、0.1、0.2 wt%）-硅橡胶多孔薄膜上的细胞活力无显著差异;在接种后第5天和第7天,石墨烯（0.5 wt%）-硅橡胶多孔薄膜上的细胞活力分别下降至石墨烯（0 wt%）-硅橡胶多孔薄膜的88.54±0.04%、83.43±0.06%;8.暴露于石墨烯后,大部分细菌细胞失去了完整性,部分细菌细胞被包裹在石墨烯中,细菌细胞内ROS水平高出空白组的2.44倍;9.体外条件下,石墨烯（0.1,0.2,0.5 wt%）-硅橡胶多孔薄膜上的细菌数量明显低于石墨烯（0wt%）-硅橡胶多孔薄膜,且随着石墨烯含量的提高,细菌存活率随之下降;10.伤后第7天,石墨烯（0.2 wt%）-硅橡胶组、石墨烯（0.5 wt%）-硅橡胶组的创面愈合率分别为87.37±2.75%、87.63±3.72%,两者无显著差异,但均显著高于其余各组;石墨烯（0.2 wt%）-硅橡胶组、石墨烯（0.5 wt%）-硅橡胶组的创面愈合时间分别为8.46±0.30天、8.62±0.30天,两者无显著差异,但均显著短于其余各组;11.伤后第7天,石墨烯（0.2 wt%）-硅橡胶组和石墨烯（0.5 wt%）-硅橡胶组的新生上皮长度分别为2325.31±208.08μm、2362.64±111.22μm,两者无显著差异,但均明显大于其余各组;伤后第7天,石墨烯（0.2 wt%）-硅橡胶组和石墨烯（0.5 wt%）-硅橡胶组的肉芽组织厚度分别为1932.06±136.32μm、1825.31±225.37μm,两者无显著差异,但均明显大于其余各组。第三章基于电荷反转的新型石墨烯-壳聚糖靶向抗菌材料的研制及其抗皮肤感染作用研究方法:1.基于氨基与羧基的缩合反应,制备石墨烯-壳聚糖;2.测定石墨烯-壳聚糖的傅里叶变换红外光谱;3.透射电镜、原子力显微镜观察石墨烯-壳聚糖的形貌,动态光散射技术检测石墨烯-壳聚糖的粒径分布;4.检测不同pH条件下石墨烯-壳聚糖的Zeta电位;5.检测石墨烯-壳聚糖的吸收光谱;6.检测石墨烯-壳聚糖的光热性能;7.扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察石墨烯-壳聚糖与细菌之间的相互作用;8.检测石墨烯-壳聚糖与细菌相互作用后的Zeta电位;9.扫描电镜观察石墨烯-壳聚糖与细胞之间的相互作用;10.CCK-8法检测石墨烯-壳聚糖的细胞毒性;11.将石墨烯-壳聚糖通过尾静脉注入小鼠体内,分别在注射后不同时间,通过组织切片、HE染色观察心、肝、脾、肺、肾的结构变化,抽取动物静脉血样,行血常规、血生化分析,了解相关系统、脏器功能变化;12.标准平板计数法检测石墨烯-壳聚糖的体外抗菌性;13.制作小鼠背部皮下脓肿模型,分别在同一只动物背部皮肤的脓肿侧及正常侧皮下注射石墨烯-壳聚糖,在注射后的不同时间点,使用近红外激光照射,通过热成像仪记录两侧的温度变化,以检测石墨烯-壳聚糖的体内靶向性;14.将石墨烯-壳聚糖注射入前述脓肿内,联合近红外激光照射进行治疗,标准平板计数法评估石墨烯-壳聚糖的体内抗菌性,定时对脓肿所致的创面进行大体观察,制备脓肿处创面组织病理切片,进行HE染色,显微镜下拍照,评估创面的愈合情况。结果:1.傅里叶变换红外光谱提示1633 cm^-1处C=O—N、1532 cm^-1处C—N—H的出现以及1726 cm^-1处羧基（C=O—O）峰强度降低,表明石墨烯-壳聚糖已经成功合成;2.石墨烯-壳聚糖呈片层状结构,粒径范围集中在250 nm左右,其厚度为1.7 nm左右;3.石墨烯-壳聚糖的Zeta电位从中性条件（pH 7.4）的较弱负电荷（-3 mV左右）逐步反转为正电荷（pH 6.3时在9 mV左右）;4.乙二醇化壳聚糖、羧基化石墨烯及石墨烯-壳聚糖在808 nm处相应的光吸收度值分别为0.008、0.252及0.441;5.在0.5 W/cm²的808 nm近红外激光照射下,石墨烯-壳聚糖的温度在照射的3分钟内随浓度增大而快速上升;在0.75 W/cm²近红外激光（808 nm）照射10分钟的条件下,0.1mg/mL、0.2mg/mL的石墨烯-壳聚糖分别从29℃上升至56.2℃和66℃;石墨烯-壳聚糖的光热转换效率为39.6%;6.在酸性条件下（pH 6.3）,金黄色葡萄球菌标准株、大肠杆菌标准株以及MRSA表面均带有较强的负电荷,石墨烯-壳聚糖表面带有较强的正电荷,可与细菌发生强烈的静电吸引,牢牢包裹住细菌,将其表面电荷由负转正;在正常生理条件下（pH 7.4）,细菌表面几乎没有石墨烯-壳聚糖存在,石墨烯-壳聚糖也不会粘附至3T3成纤维细胞表面;7.体外条件下,受试细菌同前述;近红外激光照射或羧基化石墨烯处理的细菌存活率与对照组无显著差异;经石墨烯-壳聚糖处理的细菌活力下降6%至11%;与其余各组相比,石墨烯-壳聚糖联合近红外激光照射展现出最高的抗菌效率（接近100%）;羧基化石墨烯联合近红外激光照射抗菌效率为13%至15%;经不同粒径的石墨烯-壳聚糖（小:190-342 nm;中:396-615 nm;大:712-1106 nm）处理的MRSA活力并无显著降低,联合近红外激光照射,前述三种不同粒径大小的石墨烯-壳聚糖抗菌效率均达到100%;8.成功建立小鼠背部皮下脓肿模型;在一侧脓肿部位和对侧正常皮下均分别予石墨烯-壳聚糖注射,随即行近红外激光照射,两侧的温度均快速上升至56℃左右;当在注射后的2小时、4小时分别再行近红外激光照射时,正常皮肤侧的温度显著下降,脓肿侧的温度仍然保持在56℃左右;9.经石墨烯-壳聚糖注射联合近红外激光照射治疗后的皮下脓肿组织内细菌菌落数目显著减少,仅占对照未治疗组的5%,在治疗后第10天,脓肿处创面基本愈合,炎性细胞浸润明显减少;10.体外条件下,石墨烯-壳聚糖对细胞活力无显著影响;在静脉注射石墨烯-壳聚糖后的第7天和第21天,小鼠心、肝、脾、肺、肾均未见明显结构损伤;在注射后第21天,小鼠的血常规参数、肝功及心肌损伤标志物与正常对照组之间无显著差异。结论:总结本课题,可以得到以下结论:1.我们成功制备了石墨烯-硅橡胶多孔薄膜;它具有“上小下大”的定制孔径结构,上表面的小孔可以防止创面过多的水分丧失,下表面的大孔有利于细胞粘附增殖;硅橡胶基质中石墨烯的引入明显提高了其机械性能,因而扩展了其作为高应力状态下创面敷料的应用;它具有合适的水蒸气透过率,可为创面愈合提高理想的湿性环境,同时避免创面渗液的大量积聚;它具有良好的细胞相容性;体外条件下,它可显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长;石墨烯（0.2 wt%、0.5 wt%）-硅橡胶多孔薄膜能通过增强创面再上皮化和肉芽组织形成以促进创面愈合,可以用作一种较理想的多功能创面敷料。2.我们成功制备了石墨烯-壳聚糖;它具有独特的二维结构,对近红外光有较强的吸收,具备极高的光热转换效率;在细菌感染的酸性微环境中,它可实现表面电荷快速反转并特异性地靶向包裹细菌,从而在近红外光照射下发挥直接消融细菌的作用以促进感染创面愈合;在生理条件下则不与周围正常组织细胞发生相互作用,进而最大限度减少光热治疗对周围正常组织的损害;它在体内外均具有良好的生物相容性;石墨烯-壳聚糖在皮肤创面/皮下组织细菌（尤其是多重耐药细菌）感染的治疗方面具有极大的应用前景。