研究背景：肝门部胆管癌是指原发于胆囊管开口以上的肝总管至左、右肝管部位的粘膜上皮癌,占肝外胆管癌的58—75%。由于肝门部空间狭小、与血管关系密切以及肿瘤浸润性生长的特点,手术切除率低、根治性切除率更低。但是,即使行根治性切除术后(切缘及周围组织常规病理检查无瘤细胞残余),肝门部胆管癌复发率依然很高,且主要是肝脏和肝门区的转移。因此推测微转移可能是其主要原因,且多项研究表明微转移是肿瘤预后的独立因素。因此发现能遏制或减少微转移的治疗方法是提高肝门部胆管癌治愈率的关键因素。微转移是指常规临床病理学方法不能检出的非血液系统恶性肿瘤的转移,是离开原发灶的镜检(<2mm)癌细胞沉积,在逃避免疫监视后侵犯血管并发展成肉眼可见的病变,常无任何临床表现。血管生成拟态是一种与经典肿瘤血管生成途径不同,不依赖于机体内皮细胞的全新肿瘤微循环模式,肿瘤微转移的一种重要途径。对于肝门部胆管癌,Thelen等研究发现肿瘤血管的生成与淋巴结转移、局部复发有关,并且是影响肝门部胆管癌术后生存率的重要因素。Aishima等研究结果显示肿瘤血管密度的增加促进了肝门部胆管癌的淋巴转移和血管浸润。而血管生成拟态是根治术(切缘镜检无癌细胞)后马赛克血管、血管内皮细胞血管形成的前提和基础。SLC是1997年由Nagria首次报道,属于CC类趋化因子。人SLC cDNA序列包括847个碱基,编码134个氨基酸残基,与其他趋化因子有21%~33%的同源性。SLC的基因定位于9p13,有4个外显子和3个内含子组成。SLC有活化的T淋巴细胞、内皮细胞等产生,高表达于次级淋巴组织,特别是高内皮小静脉(high endothelial venule, HEV)和淋巴结T细胞区。SLC包括CCL21和CCL19,CCL21在淋巴结的表达量更高,提示CCL21在淋巴细胞的归巢中起重要作用。CCR7是1998年由Yashida在EB病毒感染的B细胞中发现的,是SLC的高亲合力受体。含378个氨基酸残基,基因定位于17q12~q21.2。主要在幼稚T细胞、B细胞和树突状细胞表面,在记忆T细胞、NK细胞和NKT细胞也有表达。在肿瘤常见转移部位高水平表达CCL21,提示CCL21与CCR7很可能参与了肿瘤的转移与侵袭,并且认为CCR7的高表达和对CCL21的剂量依赖趋化性可能决定了肿瘤转移的方向和部位。CCL21-CCR7生物学轴在肿瘤淋巴归巢、血管生成及神经浸润方面有一定的作用。并且可以调控其它趋化因子的分泌。我们采用肝门高位切除并肝门实质—空肠吻合术做到扩大手术切除范围,尽量减少微转移的发生；对肝门部胆管癌组织进行了CCR7的检测,表明CCR7在肿瘤组织中高表达,在此基础上我们(1)从临床研究：肝门高位切除并肝门实质—空肠吻合术的解剖学基础、与传统术式的优缺点比较、在较少微转移方面的优势以及需要改进的设想。(2)从基础研究：肝门部胆管癌是否存在血管生成拟态?CCL21—CCR7生物学轴是否诱导血管生成拟态形成促进了肝门部胆管癌微转移?诱导血管生成拟态形成的机制如何?总之,从基础和临床相结合探讨较少肝门部胆管癌微转移方法,提高根治性切除率,减少术后复发率,延长病人生存时间,提高生存质量。第一部分肝门高位切除、肝门实质—空肠吻合术在BismuthⅣ型肝门部胆管癌手术中的应用目的探讨肝门高位切除、肝门实质—空肠吻合术在治疗BismuthⅣ型肝门部胆管癌中的作用。方法选取2004年3月至2011年6月期间治疗的32例行根治性切除的BismuthⅣ型肝门部胆管癌进行回顾性分析。按治疗方式分为新术式组(n=16)和传统术式组(n=16)。新术式组采用肝门高位切除、肝门空肠吻合术,传统术式组采用胆管整形后胆管空肠吻合术,两组病人均达到R0根治(切缘无癌细胞)。对两组病人手术时间、术中出血量、住院天数以及术后并发症、生存质量、生存率进行比较。结果与传统术式组比较,新术式组的手术时间(t=2.52,p<0.05)、伴肝叶或段切除数(x2=6.30,p<0.05)和住院天数(t=3.18,p<0.05)明显减少；两组之间比较术中出血量(t=1.09,p>0.05)、生存质量(t=0.68,p>0.05)和总体并发症的发生率(x2=0.65,p>0.05)无显著性差异,但是胆漏的发生率新术式组明显低于传统术式组(x2=5.09,p<0.05),而胆道感染的发生率新术式组明显于传统术式组(x2=4.43,p<0.05)；通过log-rank检验发现两组之间生存率比较有显著性差异(x2=19.10,p<0.05),新术式组在1、3、5年的生存率明显高于传统术式组。结论采用肝门高位切除、肝门实质—空肠吻合术治疗BismuthⅣ型肝门部胆管癌可提高手术切除率、减少肝实质切除量、利于胆道通畅引流,从而延长患者生存时间,提高病人生存质量。意义肝门高位切除、肝门实质—空肠吻合术简化了肝门部胆管癌手术过程,减少了接触性转移,提高了手术切除率和病人生存率,是值得推广的新的手术方式。第二部分趋化因子受体CCR7和血管生成拟态在肝门部胆管癌中的表达及其意义目的探讨趋化因子受体CCR7和血管生成拟态在肝门部胆管癌组织和细胞中的表达及其与临床病理参数的关系。方法免疫组织化学染色检测63例肝门部胆管癌手术标本和20例正常胆管组织CCR7的表达,PAS和CD34双重染色检测肝门部胆管癌组织中血管生成拟态的表达,将CCR7表达和VM形成与临床病理参数进行相关性分析；RT-PCR和Western blot检测QBC939细胞中CCR7的表达；三维细胞培养检测QBC939细胞中血管生成拟态形成。结果63例肝门部胆管癌组织中,CCR7阳性表达50例、阳性率79.4%。正常胆管中有2例表达弱阳性,阳性率10%,远低于肝门部胆管癌组织,差异具有显著性；在63例肝门部胆管癌组织标本中25例存在血管生成拟态形成,正常组织中无Vm形成；并且所有20例低分化的肝门部胆管癌中Vm全部阳性,另外在25例中分化肝门部胆管癌中5例存在Vm阳性；与临床病例参数相关性分析,CCR7和Vm在肝门部胆管癌中的表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移呈显著性相关,而与性别、年龄、肿瘤的大小、组织学类型和有无肝切除无关；单变量和多变量相关性分析CCR7、Vm、分化程度和淋巴结转移与生存率有关,而CCR7是影响肝门部胆管癌生存率的独立性因素。RT-PCR和Western-Blot结果证实在QBC939细胞中存在CCR7的表达,与组织标本的检测结果一致,并且发现QBC939细胞形成网状结构一血管生成拟态的能力。结论在肝门部胆管癌组织标本和胆管癌细胞中均存在CCR7和血管生成拟态的表达,两者有正相关关系；CCR7和血管生成拟态的表达与肝门部胆管癌患者的血淋巴结转移和肿瘤分化程度有关,而与性别、年龄、肿瘤的大小、组织学类型和有无肝切除无关；CCR7是影响肝门部胆管癌生存率的独立性因素。意义揭示了血管生成拟态形成在肝门部胆管癌微转移过程中起着非常重要的作用；CCR7可能通过血管生成拟态形成、淋巴转移途径诱导肝门部胆管癌的微转移。第三部分CCR7及CCR7-shRNA载体构建、转染及效应细胞的筛选目的构建CCR7高表达和CCR7-shRNA的真核表达载体,并转染至QBC939细胞,获得CCR7高表达、正常表达和低表达的稳定细胞株。方法从QBC939细胞中提取总RNA,设计CCR7引物应用RT-PCR得到CCR7产物；通过酶切反应,获得Insert DNA和Vector DNA,连接转化得到荧光CCR7质粒。同样,根据shRNA设计原则,采用慢病毒表达载体构建,设计shRNA特异性序列后、以R N A聚合酶Ⅲ依赖的启动子U6引导shRNA-CCR7和绿色荧光蛋白(green flurescence protein, GFP)的共同转录,来操纵一段小发夹siRNA在QBC939细胞中的表达。通过三质粒共转染293T细胞,制备表达携带CCR7不同表达的慢病毒质粒的慢病毒液。这些慢病毒液直接感染QBC9393细胞。最后用足够剂量的Puromycin杀死非转导的细胞。结果对CCR7-pEGFP质粒进行DNA序列测定,测序结果与与实验设计合成的CCR7靶基因序列完全一致；将CCR7-shRNA质粒进行DNA序列测定,测序结果与与实验设计合成的shCCR7靶基因序列完全一致。将通过慢病毒转染得到的pEGFP细胞、CCR7-pEGFP细胞和CCR7-shRNA-pEGFP细胞应用RT-PCR和Western-Blot检测CCR7的表达结果显示,与pEGFP正常对照组相比,CCR7-pEGFP高表达组CCR7表达水平明显增强；而CCR7-shRNA-pEGFP沉默组CCR7mRNA的水平表达微弱。结论成功合成了荧光标记的高表达CCR7质粒和CCR7-shRNA质粒,通过慢病毒转染最终得到了pEGFP、CCR7-pEGFP和CCR7-shRNA-pEGFP三组细胞株。意义为下一步研究CCR7高表达、正常表达和低表达对QBC939细胞VM形成、增殖、迁移、侵袭能力的影响提供保证。第四部分趋化因子受体CCR7诱导血管生成拟态形成在肝门部胆管癌微转移中的作用及其机制目的探讨趋化因子受体CCR7诱导血管生成拟态形成促进了QBC939细胞的增殖、迁移和侵袭以及CCR7发挥作用的信号途径。方法根据实验方法的需要,在培养基中含或不含CCL21将CCR7不同表达的三组细胞株分为六组：(1)pEGFP组:(2)CCR7-pEGFP组；(3)CCR7-shRNA-pEGFP；(3)pEGFP+CCL21组：(5)CCR7-pEGFP+CCL21组：(6)CCR7-shRNA-pEGFP+CCL21组。应用三维细胞培养检测各组QBC939细胞中血管生成拟态形成；细胞划痕实验和Transwell小室检测各组细胞的迁移能力；Boyden小室检测CCL21-CCR7对QBC939细胞体外侵袭能力的影响；应用MTT法检测CCL21-CCR7对QBC939细胞增殖能力的影响。最后Real time PCR检测三组细胞株中CCR7及相关6个基因wist1GAPDHIL-8VEGFPDEFPDCD4的表达。结果与对照组相比,CCR7高表达组形成VM能力和细胞增殖明显增强,而在CCR7沉默表达组形成VM和细胞增殖能力减弱,三组不同CCR7表达组加入CCL21形成VM和细胞增殖能力没有变化。划痕实验、Transwell小室和Boyden小室测定各组CCR7不同表达的QBAC939细胞的运动、迁移和侵袭能力得到的结果一致,与对照组相比,CCR7高表达组爬行能力、穿膜细胞数量明显增加,而CCR7沉默组爬行能力、穿膜细胞数量明显减少：在对照组和CCR7高表达组加入CCL21后爬行能力、穿膜细胞数量明显增加,而在CCR7沉默表达组加入CCL21后,爬行能力和穿膜细胞数量没有明显变。对三组细胞应用CCR7引物和Twist1GAPDHIL-8VEGFPDEFPDCD46个基因的引物进行qPCR检测发现,Twist1基因在三组细胞中的变化趋势同CCR7的变化一致,即在CCR7高表达组同时也高表达Twist1,而在CCR7沉默组Twist1基因也低表达。结论CCL21-CCR7生物学轴的不同表达影响了血管生成拟态的形成,从而使胆管癌细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力改变；CCR7影响VM形成、细胞增殖、迁移和侵袭的信号途径可能是通过Twist1的上皮-间质转化来实现的。意义CCL21/CCR7相互作用引起Twist1的上皮-间质转化可能是肝门部胆管癌形成VM促进微转移的重要机制之一。在积极针对原发肿瘤治疗的同时,应用趋化因子及其受体间相互作用阻断剂,加上其导致微转移信号途径中的Twist1、VM等阻断剂的协同治疗,更能明显有效的降低肝门部胆管癌的术后微转移,提高患者生存率,改善预后。