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背景：心肌纤维化(Cardiac fibrosis，CF)是心脏组织受到损伤后发生的一种病理性改变，表现为心室硬度增加，从而导致心脏收缩舒张功能障碍。肉眼可见纤维化的心脏体积变大，心腔扩张，心室壁增厚或正常，可伴有白色条索状瘢痕表现。心肌纤维化的主要组织学特征表现为细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)在心脏间质内的过度沉积和肌成纤维细胞(Myofibroblast，MF)的聚集。短期的CF可能表现为适应性，但是长期的纤维化会导致心脏实质破坏和组织功能丧失，从而引起心脏的收缩期和舒张期功能障碍以及心律失常等。在心脏组织中，纤维化的积累常会导致左心室功能障碍、心肌供氧量降低和一系列的不良结局，且心肌纤维化所引起的这些心脏电生理和机械功能的不良改变，会加剧许多心脏疾病的不良预后。值得一提的是，心肌纤维化所导致的心力衰竭(Heart Failure， HF)是全球发病率和死亡率的重要因素，是一个亟待解决的世界性医疗卫生难题。因此，调控心肌纤维化是保护心肌细胞和防治心力衰竭的一种重要的新兴策略。
经典瞬时受体电位通道(Transient Receptor Potential Canonical，TRPC)是瞬时受体电位(The transient receptor potential，TRP)离子通道超家族的一员，具有六个跨膜域的四聚体通道蛋白，是一类由受体或/和钙库操控的非选择性阳离子通道。TRPC通道蛋白广泛表达于不同组织的多种类型细胞中，表达方式和功能也表现出极大的多样性。TRPC通道的激活可导致细胞膜去极化和胞浆内Ca2+浓度的升高，从而调控细胞增殖、分化和死亡等。鉴于TRPC通道蛋白广泛参与了多种疾病的发生与发展，近年已将TRPC作为潜在的治疗靶点，研发针对TRPC通道的药物，以治疗心血管疾病、内分泌疾病、神经系统疾病、慢性肾脏疾病、疼痛、癌症等。TRPC在器官纤维化过程中所发挥的作用被各种研究所证实：肌成纤维细胞激活的过程中，TRPC6表达上调；在小鼠中敲除TRPC6会损害损伤后的真皮和心脏创面愈合；抑制TRPC6通道可有效改善肾纤维化，并保护肾脏；上调TRPC6的表达，可促进肺纤维化的形成，从而发生肺萎缩。除TRPC2外，所有TRPC通道均在心肌细胞中表达，其中一些通道在正常情况下表达不高，但在衰竭心脏中表达升高，TRPC6与心肌纤维化的研究未见报道。
目的：
本实验利用异丙肾上腺素(isoprenaline，ISO)对小鼠进行腹腔注射，构建心肌纤维化模型，探讨TRPC6在心肌纤维化的作用及其机制。
方法及结果：
1．根据基因型和注射药物将实验小鼠分为以下四组：WTSaline组WTISO组；TRPC6-/-Saline组；TRPC6-/-ISO组。对四组小鼠行相应药物腹腔注射10天，给药间隔为24h。称量小鼠体重，按每只50mg/kg/day计算并注射当日药品用量。
2．用Masson染色法检测小鼠心脏组织中胶原蛋白纤维的沉积水平；利用HE染色法检测WT小鼠和TRPC6-/-小鼠心脏组织中心肌坏死、炎细胞浸润及心肌紊乱水平差异；利用天狼猩红染色法观察WT与TRPC6-/-小鼠心脏组织中胶原蛋白纤维的沉积水平差异。实验结果显示：利用Masson及天狼猩红染色可观察到，使用大剂量ISO腹腔注射10日后，WT小鼠心脏组织可观察到明显心肌排列紊乱、胶原蛋白纤维沉积增加，TRPC6-/-小鼠较WT小鼠，心脏组织胶原纤维沉积较少；HE结果显示，WTISO组小鼠心脏组织损伤严重，可见明显心肌细胞坏死空泡、炎细胞浸润、心肌排列紊乱。TRPC6基因敲除后，心脏组织损伤程度较轻，细胞坏死及炎细胞浸润较少，组织排列紊乱程度较低。
3．利用WesternBlot方法检测各实验组小鼠心脏组织内α-平滑肌动蛋白(α-SmoothMuscleActin，α-SMA)及I型胶原蛋(collagen I，COL-I)蛋白的表达水平。实验结果显示：使用大剂量ISO腹腔注射后，WT和TRPC6-/-小鼠心脏组织中α-SMA及COL-1表达均有增加；TRPC6基因敲除后，心脏组织中α-SMA及COL-1表达水平较WT组低。利用WesternBlot及组织免疫荧光方法检测TRPC6蛋白在各组小鼠心脏组织中的表达水平。结果显示：在WT组，ISO注射可引起TRPC6蛋白表达量明显上调。
4．检测造模后小鼠心脏组织内AKT/GSK3β和ERK通路蛋白的表达情况。实验结果显示：高剂量ISO腹腔注射后，p-AKT、p-GSK3β及p-ERK蛋白表达量明显增加；敲除TRPC6后，ISO诱导的p-AKT、p-GSK3β及p-ERK表达量无显著改变。
结论：
本研究的各组实验结果综合表明，ISO可通过激活TRPC6通道蛋白进而上调AKT/GSK3β及ERK信号通路以促进心肌纤维化的产生；而Trpc6基因敲除则可通过下调AKT/GSK3β及ERK信号通路的活性，减轻心肌纤维化。
经典瞬时受体电位通道(Transient Receptor Potential Canonical，TRPC)是瞬时受体电位(The transient receptor potential，TRP)离子通道超家族的一员，具有六个跨膜域的四聚体通道蛋白，是一类由受体或/和钙库操控的非选择性阳离子通道。TRPC通道蛋白广泛表达于不同组织的多种类型细胞中，表达方式和功能也表现出极大的多样性。TRPC通道的激活可导致细胞膜去极化和胞浆内Ca2+浓度的升高，从而调控细胞增殖、分化和死亡等。鉴于TRPC通道蛋白广泛参与了多种疾病的发生与发展，近年已将TRPC作为潜在的治疗靶点，研发针对TRPC通道的药物，以治疗心血管疾病、内分泌疾病、神经系统疾病、慢性肾脏疾病、疼痛、癌症等。TRPC在器官纤维化过程中所发挥的作用被各种研究所证实：肌成纤维细胞激活的过程中，TRPC6表达上调；在小鼠中敲除TRPC6会损害损伤后的真皮和心脏创面愈合；抑制TRPC6通道可有效改善肾纤维化，并保护肾脏；上调TRPC6的表达，可促进肺纤维化的形成，从而发生肺萎缩。除TRPC2外，所有TRPC通道均在心肌细胞中表达，其中一些通道在正常情况下表达不高，但在衰竭心脏中表达升高，TRPC6与心肌纤维化的研究未见报道。
目的：
本实验利用异丙肾上腺素(isoprenaline，ISO)对小鼠进行腹腔注射，构建心肌纤维化模型，探讨TRPC6在心肌纤维化的作用及其机制。
方法及结果：
1．根据基因型和注射药物将实验小鼠分为以下四组：WTSaline组WTISO组；TRPC6-/-Saline组；TRPC6-/-ISO组。对四组小鼠行相应药物腹腔注射10天，给药间隔为24h。称量小鼠体重，按每只50mg/kg/day计算并注射当日药品用量。
2．用Masson染色法检测小鼠心脏组织中胶原蛋白纤维的沉积水平；利用HE染色法检测WT小鼠和TRPC6-/-小鼠心脏组织中心肌坏死、炎细胞浸润及心肌紊乱水平差异；利用天狼猩红染色法观察WT与TRPC6-/-小鼠心脏组织中胶原蛋白纤维的沉积水平差异。实验结果显示：利用Masson及天狼猩红染色可观察到，使用大剂量ISO腹腔注射10日后，WT小鼠心脏组织可观察到明显心肌排列紊乱、胶原蛋白纤维沉积增加，TRPC6-/-小鼠较WT小鼠，心脏组织胶原纤维沉积较少；HE结果显示，WTISO组小鼠心脏组织损伤严重，可见明显心肌细胞坏死空泡、炎细胞浸润、心肌排列紊乱。TRPC6基因敲除后，心脏组织损伤程度较轻，细胞坏死及炎细胞浸润较少，组织排列紊乱程度较低。
3．利用WesternBlot方法检测各实验组小鼠心脏组织内α-平滑肌动蛋白(α-SmoothMuscleActin，α-SMA)及I型胶原蛋(collagen I，COL-I)蛋白的表达水平。实验结果显示：使用大剂量ISO腹腔注射后，WT和TRPC6-/-小鼠心脏组织中α-SMA及COL-1表达均有增加；TRPC6基因敲除后，心脏组织中α-SMA及COL-1表达水平较WT组低。利用WesternBlot及组织免疫荧光方法检测TRPC6蛋白在各组小鼠心脏组织中的表达水平。结果显示：在WT组，ISO注射可引起TRPC6蛋白表达量明显上调。
4．检测造模后小鼠心脏组织内AKT/GSK3β和ERK通路蛋白的表达情况。实验结果显示：高剂量ISO腹腔注射后，p-AKT、p-GSK3β及p-ERK蛋白表达量明显增加；敲除TRPC6后，ISO诱导的p-AKT、p-GSK3β及p-ERK表达量无显著改变。
结论：
本研究的各组实验结果综合表明，ISO可通过激活TRPC6通道蛋白进而上调AKT/GSK3β及ERK信号通路以促进心肌纤维化的产生；而Trpc6基因敲除则可通过下调AKT/GSK3β及ERK信号通路的活性，减轻心肌纤维化。