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第一部分Lgr5+、RSPO-1、C-kit在人类结直肠癌中的表达及临床意义目的：探讨人类结直肠癌组织中浸润型肥大细胞的表达情况,及其分泌的RSPO-1蛋白的表达与临床病理资料之间的关系。方法：2012年3月～2012年4月,收集结直肠癌、癌周组织及手术近端切缘组织标本2l例,采用免疫组织化学染色方法、双标免疫荧光方法和免疫蛋白印迹法检测各组织中RSPO-1和C-kit蛋白的表达,实时定量聚合酶链反应检测RSPO-1和Lgr5的nRNA的表达。比较肥大细胞及其表达的RSPO-1与临床病理特征。结果：免疫组化检测发现RSPO-1在结直肠癌组织、癌周组织的阳性表达率分别为90.48%和100%,高于手术近端切缘组织的80.95%,差异有统计学意义(P<0.0001);C-kit在癌周组织、手术近端切缘组织的阳性表达率分别为100%和80.95%,高于癌组织28.57%,差异有统计学意义(P<0.0001)；癌周组织中C-kit的强阳性(++)表达强度与肿瘤分化程度及淋巴结转移分站情况呈正相关(P值分别为0.02和0.015),而RSPO-1的强阳性(++)表达与肿瘤分化程度、淋巴转移、浸润深度和分期无明显相关性(P值分别为0.194、0.114、0.5、0.44)；实时定量聚合酶链反应和免疫蛋白印迹检测结直肠癌组织中Lgr5的相对表达也明显高于癌周组织,癌周组织中的RSPO-1相对表达量明显高于肿瘤及近端切缘组织。结论人类结直肠癌局部环境中的具有浸润型肥大细胞,同时也表达RSPO-1,癌周组织局部环境中浸润型肥大细胞的密度与肿瘤分化程度及淋巴结转移分站呈正相关；人类结直肠癌组织中的受体Lgr5呈明显高表达状态。因此,浸润型肥大细胞分泌的RSPO-1可能与结直肠癌干细胞表面受体Lgr5结合共同维持结直肠癌干细胞突变的稳定性及部分恶性生物学效应。第二部分肥大细胞参与小鼠结肠癌干细胞干性维持的研究目的：浸润型肥大细胞介导的RSPO-1在小鼠结直肠癌干细胞系CT-26(wt)中影响Wnt/β-catenin信号通道的机制研究方法：培养小鼠浸润型肥大细胞系P815,小鼠结肠癌细胞系CT-26；将普通CT-26细胞进行无血清悬浮培养获得球细胞：提取细胞RNA进行干性检测；将P815细胞系通过不同浓度SCF进行刺激悬浮培养,提取细胞蛋白质检测RSPO-1等目的蛋白的表达情况；将CT-26球细胞与P815细胞进行无血清不同干预悬浮共培养,观察生长情况后提取CT-26球细胞的总RNA及蛋白质,用Real-time PCR、Western-blot检测细胞系中β-catenin、TCF1/4、c-Myc mRNA及蛋白表达情况。结果：Western-Blot显示小鼠浸润型肥大细胞系P815在受到lOng/ml的SCF刺激后48h表达的RSPO-1明显升高,伴随着SCF浓度的增加和刺激时间的增加,RSPO-1表达无明显增高趋势；受SCF刺激后Gremlin及Noggin不表达；Real-time PCR检测CT-26球细胞受到RSPO-1刺激后的球细胞CD133+及SOX2干性标记物表达明昆高于未受刺激及阻断RSPO-1的细胞群;Western-Blot显示：CT-26球细胞与P815细胞系悬浮共培养后下游Wnt/β-catenin信号通道活化,胞浆及胞核内的β-catenin、Tcf4及c-Myc蛋白明显高于较未受刺激及阻断组细胞系。结论小鼠肥大细胞介导的RSPO-1可刺激结肠癌干细胞下游Wnt/β-catenin信号通路的活化,P-catenin在胞浆累积进入胞核内激活转录因子TCF/Lef家族成员,因此肥大细胞介导的RSPO-1对结肠癌肿瘤干细胞的“干性”维持具有重要作用。第三部分肥大细胞参与Lgr5+小鼠结肠炎癌模型中Wnt/β-catenin通路活化的研究目的：浸润型肥大细胞介导的RSPO-1在小鼠Lgr5+结直肠炎癌模型中影响Wnt/p-catenin信号通道的机制研究方法：通过经典的化学诱导法(AOM+2%DSS)构建Balb/c雌性小鼠结肠炎癌模型。观察生长情况后,分别在第8周、16周和32周通过免疫组化和流失细胞仪检测小鼠Lgr5+结肠癌及癌周组织中肥大细胞数量和β-catenin、 TCF4、c-Myc基因表达情况。通过Western-blot方法检测小鼠结肠癌组织、癌周组织及正常组织的RSPO-1表达情况。结果：入组的雌性小鼠在第32周成瘤率为20%(2/10)；Balb/c小鼠注射AOM及饮2%DSS后2和4周,死亡率分别达到20%(2/10)和40%(4/10)；对比正常组或炎症组(仅DSS诱导),Lgr5+结肠上皮细胞(CD45-、CD31-、CD326+)的比例及其Wnt//β-catenin信号通路的活化水平均明显增加；AOM+2%DSS诱导组的结肠癌模型小鼠其β-catenin、TCF、c-Myc明显增高,浸润肥大细胞定位于结肠癌侵袭生长的边缘,其分泌的RSPO-1蛋白明显增高。结论小鼠结肠炎癌模型中肥大细胞介导的RSPO-1持续激活了Lgr5+结肠干细胞下游Wnt/β-catenin信号通路的活化。