缺血性脑血管疾病(Ischemic cerebrovascular disease,ICVD)是中老年人的常见病和多发病,占全部脑卒中的80%。脑对缺氧敏感,不仅缺血缺氧造成严重的局部脑组织损害和功能损害,恢复血流灌注后脑缺血再灌注损伤会使缺血性损伤加重转变成不可逆性损伤。缺血性脑血管疾病常常会损害患者的认知功能,引起感觉功能障碍、运动神经功能障碍、精神意识异常,出现判断能力改变、智商得分降低、记忆能力衰减、人格类型改变、抑郁等。海马与学习记忆、认知功能关系最为密切,脑缺血再灌注导致海马神经元严重受损,尤其是氧化应激损伤及神经元凋亡增加,可能是认知功能障碍的主要原因。丁苯酞是从食用植物芹菜籽中提取的有效成分,化学名为消旋-3-正丁基苯酞,于2002年被中国食品药品监督管理局批准用于治疗缺血性中风,许多临床研究表明,丁苯酞不仅改善了缺血性中风的症状,而且还有助于长期康复。丁苯酞治疗缺血性中风的潜在机制,可能与其从多靶点实现对神经元细胞的保护作用有关。丁苯酞对脑缺血再灌注损伤后大鼠认知功能的影响,以及氧化应激损伤、线粒体功能障碍在其机制中的作用目前研究报道尚少。目的:本研究采用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型,观察丁苯酞对脑缺血大鼠神经功能、认知功能的改善作用,初步探讨丁苯酞是否通过减轻氧化应激损伤、改善线粒体功能来发挥神经元保护作用。方法:选取成年健康雄性SD大鼠80只随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组、低剂量丁苯酞治疗组和高剂量丁苯酞治疗组。采用线栓缺血2小时后再灌注法建立大鼠脑缺血再灌注模型,假手术组则不插入线栓。造模后所有存活大鼠全部纳入实验,第2天治疗组分别采用低剂量40 mg/kg丁苯酞、高剂量80 mg/kg丁苯酞灌胃治疗,每天1次,持续给药7天,假手术组与模型组则给予等体积的玉米油。在大鼠治疗7天后进行神经功能缺损评分(Longa法),术后1个月左右对大鼠进行行为学测试,采用Morris水迷宫进行定位航行实验、空间探索实验评价大鼠的空间学习能力、空间记忆能力。通过HE染色测定大鼠脑部海马神经元形态学变化,TUNEL染色、大鼠皮质神经元Caspase-3/Caspase-9表达检测细胞凋亡。分离海马区神经元细胞通过JC-1染色流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位变化,DCFH-DA荧光染色检测神经元细胞内活性氧含量,评价线粒体膜电位引起脑缺血大鼠认知功能障碍的细胞凋亡机制。结果:(1)通过线栓法成功建立大鼠脑缺血再灌注模型,假手术组大鼠未发生神经功能缺损,模型组大鼠神经功能缺损评分最高,低剂量丁苯酞治疗组大鼠评分有下降趋势,而高剂量丁苯酞治疗组大鼠神经功能缺损评分较模型组下降了近40%,有统计学差异(P<0.05)。(2)造模1个月后,大鼠定位航行实验检测大鼠的空间学习能力,历经5天,随着天数的增加,各组大鼠逃避潜伏期时间明显逐渐缩短,脑缺血再灌注模型组各时间点逃避潜伏期时间明显较假手术组延长(P<0.05);低剂量和高剂量丁苯酞治疗组大鼠的逃避潜伏期时间均明显低于脑缺血再灌注模型组,并且随着丁苯酞剂量增加,其逃避潜伏期时间也更短(P<0.05)。(3)完成大鼠定位航行实验后的第2天进行大鼠空间探索实验,检测大鼠的空间记忆能力,观察记录四组大鼠的目标象限停留时间,发现脑缺血再灌注模型组明显低于假手术组,差异显著(P<0.05);丁苯酞治疗组明显比脑缺血再灌注模型组高,差异显著(P<0.05);高剂量丁苯酞治疗组高于低剂量丁苯酞治疗组。(4)HE染色观察脑缺血再灌注后脑组织细胞的形态学改变,发现脑缺血再灌注模型组细胞丢失严重,尤其海马的CA1区神经元细胞丢失最为严重。经低、高剂量丁苯酞治疗后,神经元细胞损伤均出现一定程度减轻,说明丁苯酞对脑缺血再灌注后的大鼠海马神经元具有保护作用。(5)TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡状态,发现脑缺血再灌注模型组TUNEL表达阳性细胞明显增高,高剂量丁苯酞治疗组海马中TUNEL表达阳性细胞数量明显低于低剂量丁苯酞治疗组和脑缺血再灌注模型组,差异存在统计学意义(P<0.001)。(6)提取海马组织蛋白,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspa se-9的表达情况,结果显示假手术组中Caspase-3/Caspase-9低表达,脑缺血再灌注模型组Caspase-3/Caspase-9表达明显增高(P<0.05),经丁苯酞治疗后C aspase-3/Caspase-9表达水平降低,尤其随着丁苯酞组剂量升高,Caspase-3/Caspase-9表达降低更为明显(P<0.05)。(7)分离海马区神经元细胞进行JC-1染色,通过流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位变化,结果显示脑缺血再灌注模型组大鼠细胞中线粒体膜电位较假手术组降低了47.7%,丁苯酞治疗组可以明显提高线粒体膜电位,特别是高剂量丁苯酞治疗组效果最好,恢复到了假手术组的80%(P<0.01),说明丁苯酞可以明显改善脑缺血再灌注损伤对海马区神经元的线粒体损伤。(8)DCFH-DA荧光探针标记神经元细胞内的ROS,经荧光显微镜观察拍照,结果显示假手术组细胞中只有少量DCFH绿色荧光,而脑缺血再灌注模型组细胞中DCFH绿色荧光显著升高,说明ROS产生增加,而使用丁苯酞治疗后,绿色荧光强度较模型组明显减少,具有显著差异(P<0.01),说明丁苯酞可以明显抑制脑缺血再灌注损伤过程中产生的ROS,减少神经元的氧化应激损伤。结论:丁苯酞对于脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能、认知功能改善效果突出,特别是大剂量丁苯酞,能够有效改善神经功能评分、提升治疗组大鼠的空间学习能力和空间记忆能力。同时丁苯酞可明显提高脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元的线粒体膜电位,减少脑细胞内活性氧的产生,降低凋亡蛋白Caspase-3/Ca spase-9表达,抑制神经元细胞凋亡,减少海马CA1区的神经元丢失,有利于脑缺血大鼠海马区神经元细胞的功能恢复。