苯海索对MCAO大鼠血脑屏障上P-糖蛋白变化的影响

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目的:探索苯海索(trihexyphenidyl,THP)对大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)上P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)变化的影响及其相关机制。方法:(1)选用体重200-300 g雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,使用改良的Longa线栓法制作MCAO大鼠模型。将Longa评分≥2的大鼠纳入后续实验;大鼠分为五组:低剂量THP(0.375 mg/kg)组、中剂量THP(0.750 mg/kg)组、高剂量THP(1.000mg/kg)组,模型组(MCAO)和假手术组(Sham);MCAO手术4小时后,大鼠神经功能采用神经功能损伤评分(m NSS)系统进行评估。随后将大鼠在深度麻醉的状态下处死,迅速取出大鼠的脑组织进行TTC染色,计算各组大鼠脑梗死体积。(2)MCAO手术3.5小时后,向各组大鼠静脉内分别注射荧光素钠(fluorescein sodium,Na F)和罗丹明123(Rhodamine123,Rh123),半小时后心脏灌注生理盐水,快速取脑,并用冰冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)匀质化,离心后取上清液,用BCA法测定蛋白质含量,使用全波长酶标仪检测脑组织Na F和Rh123的荧光强度,最后根据Na F和Rh123的标准曲线计算单位蛋白质所含Na F和Rh123的量;各组大鼠脑内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的含量采用DCFH-DA荧光探针测定。(3)利用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)探索THP对MCAO大鼠BBB上P-gp与p-AKT,pERK1/2,p-IκB,p65,p-JNK和AP-1,的影响;用免疫印迹法(western blot,WB)检测MCAO大鼠脑毛细血管内皮细胞上P-gp,ERK1/2、AKT、NF-κB、JNK、AP-1及其磷酸化的分子表达水平。结果:(1)改良的Longa的线栓法能够制作稳定的大鼠脑缺血模型;MCAO后4小时大鼠缺血侧梗死体积约为17±1%,0.750 mg/kg和1.000 mg/kg的THP能够显著减轻MCAO诱导的脑组织损伤(梗死体积分别为7±2%与4±1%)。m NSS评分监测显示,MCAO大鼠伴随明显的神经功能损伤,1.000 mg/kg的THP降低MCAO大鼠神经损伤评分,提高了大鼠的运动能力。(2)MCAO后4小时,单位质量蛋白所含Na F的比值显著升高,大鼠BBB结构破坏,通透性增加。单位质量蛋白所含Rh123的比值降低,P-gp活性增强。0.750 mg/kg和1.000 mg/kg的THP能够抑制上述变化,部分逆转了MCAO诱导的BBB通透性增加以及P-gp的功能亢进;MCAO损伤后大鼠脑内ROS含量明显升高,0.750 mg/kg和1.000 mg/kg的THP能够显著降低MCAO大鼠脑内ROS含量。(3)ICH结果显示MCAO大鼠BBB上P-gp的表达水平与AKT、ERK1/2、NF-κB、JNK以及AP-1的激活呈正相关;蛋白电泳结果显示MCAO后脑毛细血管内皮细胞上P-gp的表达增加,AKT、ERK1/2、NF-κB、JNK以及AP-1激活。经过0.750mg/kg和1.000 mg/kg的THP处理后,减弱了P-gp的过度表达,并且一定程度上抑制了AKT、ERK1/2、NF-κB、JNK以及AP-1的激活。结论:THP能够减轻MCAO诱导的大鼠脑组织损伤;通过降低MCAO大鼠脑组织ROS含量,抑制AKT、ERK1/2、NF-κB、JNK以及AP-1的激活,进而抑制BBB上P-gp的过表达。
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