脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,约占所有原发性脑肿瘤的28%,其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）患者的5年生存率仅为5.1%。GBM具有明显的免疫抑制特征,如淋巴细胞浸润受限及免疫检查点分子表达较低等,现有免疫治疗方法均效果不佳。溶瘤病毒（viruses,OVs）是治疗多种肿瘤的有效手段。目前已有4种溶瘤病毒被批准应用于临床,其中Delytact（teserpaturev/G47?）在日本获批用于治疗胶质瘤。在临床试验中,该病毒立体定向注射入肿瘤局部后显示出一定的抑制肿瘤生长效果。然而,由于胶质瘤本身高度的异质性和免疫抑制微环境,以及该病毒的治疗策略中一方面未携带抗肿瘤免疫因子,另一方面病毒仅局部注射一次而非静脉注射反复多次给药,G47?的肿瘤治疗效果有限。痘苗病毒（vaccinia virus,VV）具有诸多固有特征,在治疗效果及安全性上明显优于其他溶瘤病毒。VV进入肿瘤细胞不需要特定的表面受体,因此更适合治疗高度异质性的肿瘤;大负载量以携带关键性的肿瘤治疗因子基因;复制过程中的多种存在形式及免疫逃逸特性使其具备可静脉注射用药的潜力以便反复多次给药。除此以外,VV还具有快速的细胞质内生命周期,被用作天花疫苗所体现的良好的安全性,可在缺氧环境中复制,可诱导免疫原性细胞死亡途径激活以及可在肿瘤微环境内诱导血管塌陷等特点。这都表明痘苗病毒可作为一种效果优、安全性好的抗肿瘤生物治疗手段。我们课题组的前期研究发现,胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase,TK）缺失的痘苗病毒李斯特株（VVLΔTK）具有较强的肿瘤杀伤和选择性复制能力。而后,通过删除其N1L基因,在降低病毒的神经毒性从而增强安全性的同时,激活NK和T细胞,充分提升体内抗肿瘤效果。此后,在保持了病毒内源性B5R基因完整的同时,在其TK区H5启动子下插入仅保留信号肽,茎（stalk,S）,跨膜结构域（transmembrane,T）和细胞质尾区（cytoplasmic tail,C）的B5R基因,即构建VVLΔTK-STCΔN1L。这一系列改造在不削弱病毒总体复制能力的前提下,明显提升了细胞外包膜病毒（extracellular enveloped virus,EEV）的生成,从而提高病毒在体内播散的能力,具备更强的静脉全身应用潜力。为了进一步发挥VV的临床应用潜力,优化静脉给药效果,我们利用了实验室前期研究中建立的一种新型溶瘤痘苗病毒给药方式。即在用药前口服PI3Kinaseδ抑制剂CAL101瞬时抑制巨噬细胞对VV的吞噬作用,是的静脉注射病毒更有效地感染肿瘤细胞。相比于肿瘤局部注射,此用法避免了反复给药所需的开颅手术风险,更加贴近临床应用。此外,已有报道白细胞介素21（interleukin 21,IL-21）能通过多种途径增强机体的抗肿瘤免疫。IL-21可诱导体内T细胞的活化尤其是记忆性T细胞的分化,抑制FOXP3+调节性T细胞的发育,促进B细胞产生肿瘤特异性Ig G,诱导NK和NKT细胞的成熟、活化并增强其细胞杀伤能力,使促肿瘤的M2极化巨噬细胞向M1表型极化,以及通过降低内皮细胞中VEGFR1和TIE1的表达来抑制血管生成。更重要的是,IL-21不同于其他细胞因子,即使较高剂量地使用,也不会带来严重的副作用。因此我们在VVLΔTK-STCΔN1L病毒载体中共表达小鼠白介素21（mouse interleukin-21,m IL-21）,以期进一步增强病毒的抗肿瘤效果。溶瘤病毒不仅可通过病毒复制而特异性杀伤肿瘤细胞,更能释放抗原激起强大的系统性抗肿瘤免疫反应,改善肿瘤免疫微环境,形成长期持久的抗肿瘤免疫记忆,诱导淋巴细胞浸润。这与免疫检查点抑制剂具有协同作用,因此我们联用α-PD1,探索其联合治疗的效果。本研究首先体外验证了VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21和VVLΔTK-STCΔN1L在GBM细胞中的复制和杀伤能力。在病毒感染多个GBM细胞系24、48、72、96小时后分别检测培养皿中病毒滴度,计算病毒在不同的GBM细胞系中复制的效率,并通过ELISA法检测培养皿上清液中病毒携带的免疫因子m IL-21的表达水平。其后,通过MTS法检测倍比稀释的病毒感染后存活的肿瘤细胞数,计算病毒对各GBM细胞系的杀伤效果。结果表明,两种溶瘤病毒均可在小鼠胶质瘤细胞内高效复制。VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21可在其感染的肿瘤细胞中大量合成m IL-21。两种溶瘤病毒在体外对不同小鼠GBM细胞均具有较强的杀伤能力,且两病毒的杀伤能力无明显差异。为进一步验证VVLΔTK-STCΔN1L和VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21及联用α-PD1在体内对GBM的治疗作用,我们选用小鼠GBM细胞系GL-261建立了C57BL/6小鼠皮下瘤及原位移植瘤模型。分别使用VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21及其未携带m IL-21的对照病毒VVLΔTK-STCΔN1L局部瘤内注射或口服CAL101后静脉注射,联用或单独使用α-PD1进行治疗。通过记录动物模型的生存状态、肿瘤生长曲线、生存期等手段,评估VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21联用α-PD1疗法对小鼠GBM皮下瘤或原位移植瘤的安全性和有效性。结果显示,VVLΔTK-STCΔN1L、VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21、α-PD1单独应用瘤内注射治疗小鼠GBM皮下瘤模型,口服CAL101后静脉注射治疗小鼠皮下瘤及原位移植瘤模型时,均有一定的肿瘤抑制作用。其中使用VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21联用α-PD1治疗效果最佳,可显著消除小鼠皮下瘤（清除率:局部注射80%,静脉注射50%）、原位移植瘤模型的肿瘤（清除率71.4%）,极大延长小鼠模型的生存期,提升存活率,在安全性和有效性上均有突出表现。在此基础上,我们采用了以流式细胞术为主的方法揭示这一治疗效果背后的免疫学改变。对小鼠GL-261皮下瘤模型分组后分别使用PBS,VVLΔTK-STCΔN1L,VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21和VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21+α-PD1治疗。开始治疗当日记为D1,其后D3,D5进行共3次治疗,并于D7、14、21,每组随机取3只小鼠,收集其淋巴结、脾脏、皮下瘤、血清。使用流式细胞术分析不同组织免疫细胞亚群,并通过测定脾脏细胞与不同刺激物共培养后IFN-γ的释放,评估小鼠抗肿瘤免疫记忆活化水平。对肿瘤样本免疫组化法检测PD-L1表达,对血清ELISA法检测m IL-21水平。研究结果证实,VVLΔTK-STCΔN1L和VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21有效激活了小鼠皮下瘤模型局部和全身的抗肿瘤免疫,提升了脾脏、淋巴结、肿瘤内CD4+,CD8+TCM细胞比例,上调了CD122表达,诱导产生了抗肿瘤干性记忆T细胞,促使巨噬细胞向抗肿瘤的M1表型方向极化,促进DC、NK细胞活化,其中联用α-PD1组更为显著。溶瘤病毒治疗后,小鼠模型有效表达了其携带的抗肿瘤因子m IL-21,皮下瘤组织中PD-L1的表达大幅提升。病毒治疗组脾脏细胞在使用病毒蛋白B8R,GL-261细胞和裂解的GL-261细胞刺激后IFN-γ分泌明显提高,表明小鼠产生了极强的针对病毒和肿瘤的免疫记忆及应答。综上,我们证实了,VVLΔTK-STCΔN1L-m IL-21在瘤内和静脉给药后,大幅重塑了肿瘤免疫微环境,诱导产生了强大的抗肿瘤免疫反应,从而控制了小鼠皮下和原位瘤模型中肿瘤的生长,延长了其生存期。与α-PD1联合应用,治疗效果显著提升。更重要的是,本研究还揭示了在病毒治疗后,产生了干细胞记忆T细胞,发挥了强大而持久的抗肿瘤活性。