目的:通过对永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)进行体外香烟烟雾染毒,建立恶性转化细胞模型。通过检测BEAS-2B细胞恶性转化过程中组蛋白H3K9乙酰化水平及部分相关抑癌基因mRNA表达水平的改变,探索吸烟致肺癌的发生机制,并为吸烟致肺癌的防治及早期分子标志物的筛查提供理论依据。方法:BEAS-2B细胞用LHC-8培养基于37℃,5%CO2培养箱中培养,0.25%胰酶消化处于对数生长期的细胞以1.5×105个/皿接种于Transwell培养皿中,培养箱中培养24h后将Transwell培养皿置于细胞气体染毒装置中,Transwell膜上方持续泵入香烟烟雾直接对细胞进行染毒,膜下方通入培养基保持细胞湿润,染毒装置内氧气浓度恒定于21%,水浴维持染毒腔温度恒定于37℃,每次同时染毒3个Transwell培养皿。通过CCK-8法检测不同香烟烟雾浓度以及不同时间后的细胞增殖抑制率,确定合适的染烟浓度与时间以进行长期连续染毒。染烟两次后将Transwell培养皿中的细胞消化,种于培养皿中常规培养,待生长至对数生长期后收集细胞,取部分细胞继续下一次染烟,其余常规培养及传代,细胞连续染烟两次作为染烟一代,共染烟30代,传代40代。对照组细胞暴露于烟雾浓度为0%的相同装置中,其余条件同染毒组。分别检测对照组和染烟第1代、10代、20代、30代细胞及各自传代40代后其周期、凋亡率、ROS水平以及软琼脂克隆形成实验检测细胞恶性转化的情况。通过ChIP-seq来高通量检测对照组和染烟30代传代40代组细胞之间组蛋白H3K9乙酰化差异改变位点。用荧光定量PCR检测对照组及各染烟组细胞MGMT、P21WAF1、FHIT、RARβ、PTEN基因mRNA表达情况。通过CCK-8法确定组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)的作用浓度及时间,荧光定量PCR检测对照组及Sm20-40和Sm30-40组细胞TSA作用前后MGMT、P21WAF1、FHIT、RARβ、PTEN基因mRNA表达情况。结果:(1)cck-8结果:根据cck-8结果显示,在染烟时间相同的条件下,随着染烟浓度的升高,细胞增殖抑制率逐渐上升;在烟雾浓度相同的条件下,随着染烟时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐上升,最终确定以香烟烟雾浓度为20%,每次染烟10分钟作为细胞长期连续染烟的条件,在此条件下,染烟后细胞增殖抑制率在40%左右。(2)基础指标检测:beas-2b细胞经香烟烟雾持续染毒10代并传代至40代后已出现形态学改变,异形性细胞增多,细胞呈复层重叠生长,随着染烟及传代代数的增加,细胞形态学和生长趋于稳定,与癌细胞的生长特性相类似。与对照组相比,各染烟祖细胞g1期比例均有所降低(p<0.05),s期细胞比例均有所上升(p<0.05),染烟组细胞传代后凋亡率均较染烟初期明显降低,同时,染烟组细胞内ros水平均较对照组细胞明显上升,且随着染烟代数的增加而增加。(3)细胞恶性转化程度改变:对照组细胞在软琼脂中克隆形成能力较弱,克隆形成率在1.7%左右,且克隆体积较小,但随着染烟代数的增加以及传代,细胞克隆形成能力逐渐增强,克隆形成率增加,且克隆体积较大,染烟30代传代至40代的细胞克隆形成率最高,可达30%以上(p<0.05)。(4)高通量检测组蛋白乙酰化差异位点:通过对chip-seq的结果分析,与对照组相比,染烟组细胞共检测到155个基因启动子区组蛋白h3k9乙酰化水平升高,892个基因启动子区组蛋白h3k9乙酰化水平降低。(5)基因表达改变:选择了一些基因进行mrna表达检测验证与分析。qpcr结果显示,与对照组相比,染烟组细胞mgmt、p21waf1、fhit、rarβ、pten基因mrna表达水平均降低;通过cck-8法确定给予细胞75nmol/l曲古抑菌素a(tsa)作用24h后,对照组细胞5种基因mrna表达水平较tsa作用前无明显变化,染烟组细胞fhit、rarβ基因mrna表达水平较tsa作用前也无明显改变,而mgmt、p21waf1、pten基因mrna表达水平较tsa作用前明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.建立了体外香烟烟雾染毒诱发beas-2b细胞恶性转化模型,且确认了细胞恶性程度随着染烟代数及传代代数的增加而呈剂量效应关系。2.筛选出了在细胞恶性转化过程中组蛋白h3k9乙酰化差异位点,在细胞恶性转化过程中,mgmt、fhit、p21waf1、rarβ、pten基因表达均降低,其中fhit、rarβ基因表达改变不受组蛋白乙酰化修饰的影响,mgmt、p21waf1基因表达改变主要受组蛋白乙酰化修饰的调控,而PTEN基因的表达改变部分归因于组蛋白乙酰化修饰,证明了组蛋白乙酰化修饰对部分基因的表达起到了调控作用,为吸烟致肺癌的防治及早期分子生物标志物的筛查提供了理论依据。