肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一,化学药物为其治疗的重要手段,但肿瘤细胞产生耐药性是影响化疗治疗效果的重要原因之一。MDR的产生是多种基因产物共同作用的结果。目前认为多药耐药性形成的原因主要有ATP结合膜糖蛋白如P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的过表达或活性升高,谷胱甘肽-S-转移酶或蛋白激酶C的表达、活性增加,DNA拓扑异构酶Ⅱ的水平下降或性质改变以及抗凋亡蛋白的高表达,均可使肿瘤细胞产生耐受性。川芎嗪是中药川芎的主要有效成分之一,已有很多文献报道它具有逆转肿瘤多药耐药的活性,是中药拮抗肿瘤多药耐药的热点化合物之一。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成极性和水溶性较大的代谢物而被迅速排出体外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺点。经川芎嗪及其衍生物构效关系研究,证实吡嗪环为其基本药效基团；2,3,5,6位甲基为药代基团。茋类衍生物具有逆转多药耐药、抗肿瘤细胞侵袭、黏附等广泛的抗肿瘤活性,其代表化合物白藜芦醇抗肿瘤活性已被科学界所认可。因此,以白黎芦醇为结构模型,在保持其基本骨架不变的前提下,以吡嗪环替代其中一个苯环,即在川芎嗪侧链上引入取代苯乙烯基,设计合成了一系列川芎嗪茋类衍生物。以白藜芦醇的活性基团取代川芎嗪分子的药代基团,以期克服川芎嗪体内半衰期短、生物利用度低等缺点,并通过协同作用增强药效,提高肿瘤多药耐药逆转效果。在本课题中,对合成的该系列川芎嗪茋类衍生物进行了活性筛选,并对其中具有较好逆转活性的DLJ14在阿霉素白血病耐药株K562／A02中的多药耐药逆转作用及其可能机制进行了研究。在本课题中,首先采用MTT(溴化-(4,5)-二甲基-2-噻唑基-2,5-二苯基四噻唑)法检测K562／A02耐药倍数、化合物逆转活性以及化合物自身的细胞毒性作用。利用阿霉素的自发荧光测定K562／A02及K562细胞内阿霉素蓄积情况。对化合物DLJ14体外逆转MDR作用机制的研究,首先考察对P-gp耐药途径的影响。采用罗丹明123自发荧光测定方法测定细胞内罗丹明123的蓄积,考察DLJ14对P-gp外排泵功能的影响；采用荧光素-荧光素酶法分析K562／A02及K562细胞中ATP含量,考察DLJ14对P-gp能量依赖性的影响；采用无机磷释放法观察DLJ14对ATPase活性的影响；采用western blot法和Realtime-PCR法观察DLJ14对K562／A02细胞内P-gp的蛋白表达及其mRNA水平的影响。其次,考察化合物DLJ14对GSTπ耐药途径的影响。利用GST和GPX可以催化GSH与1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)生成带颜色的化合物,用紫外分光光度计测定其吸光度值检测细胞内GST、GPX活性及GSH水平。用western blot和Realtime-PCR法检测DLJ14对K562／A02及K562细胞GSTπ蛋白表达及其mRNA水平的影响。同样采用western blot法检测DLJ14对两种细胞内c-jun氨基末端激酶(JNK)及其磷酸化形式(p-JNK)表达的影响。实验结果如下：一、川芎嗪茋类衍生物逆转耐药活性筛选K562／A02和K562细胞对阿霉素(Adr)的IC50分别是4.66±0.27μmol／L,0.035±0.009μmol／L,耐药倍数为133.3倍,具有稳定的耐药性；对24个川芎嗪茋类衍生物进行逆转多药耐药活性筛选,其中DLJ14、DLJ21及DLJ29表现出较好的逆转活性,20μmol／L浓度时逆转倍数分别为22.46,7.28及9.16。DLJ14对K562／A02及K562细胞的毒性作用均较弱,20μmol／L浓度作用120h对两种细胞的抑制率分别为27.20%,28.56%,而10μmol／L VP则为48.70%及41.70%。在测定阿霉素的蓄积实验中,未加药处理的K562／A02细胞中阿霉素的浓度仅为K562细胞的42.3%,而在加入DLJ14处理之后,两种细胞中的阿霉素蓄积均显著增加并呈现剂量依赖性。二、DLJ14对P-gp外排泵的逆转耐药机制研究对P-gp耐药途径的研究中,首先测定了细胞内罗丹明123的蓄积。在未加药处理之前,K562／A02细胞中罗丹明123的浓度仅为K562细胞的33.64%,而在加入具有逆转活性的DLJ14之后,K562／A02细胞中的罗丹明123蓄积显著增加并呈现剂量依赖性,而K562细胞中罗丹明123浓度无明显变化。通过无机磷释放法测定细胞中ATP酶活性,实验结果显示耐药株K562／A02细胞中ATPase活性高于敏感株K562细胞,10,20μmol／L DLJ14可以显著降低K562／A02细胞中的ATPase活性。而各浓度的DLJ14对K562中ATPase活性基本没有影响。另外,在通过荧光素-荧光素酶法测定细胞内ATP含量的实验中,DLJ14(2.5,5,10,20μmol／L)可不同程度地降低K562／A02细胞内ATP水平,但对K562细胞内ATP水平的影响程度较弱。Western blot结果显示,K562／A02细胞内P-gp有较强表达,而K562细胞内则无P-gp表达。DLJ14对K562／A02细胞中P-gp表达无明显影响。Realtime-PCR法检测P-gp mRNA水平,结果显示K562细胞中Mdrl基因mRNA表达水平远远低于K562／A02细胞,而高浓度剂量20μmol／L DLJ14可以少量降低Mdrl基因mRNA表达水平,其余低剂量DLJ14则无显著作用,其差异不具有统计学意义。三、DLJ14对GSTπ相关通路的逆转耐药机制研究对GSTπ相关通路的逆转耐药机制的研究中,耐药株K562／A02细胞中的GST, GPX活性显著高于K562细胞。在经过5,10,20μmol／L DLJ14处理K562／A02细胞72h后,GST活性分别降低3.26%,11.57%及20.77%,而GPX活性分别降低18.80%,32.83%及42.61%,具有剂量依赖性。而K562／A02细胞内GSH水平低于K562细胞,经5,10,20 gmol／L DLJ14处理后K562／A02细胞内GSH含量升高,分别增加4.86%,18.69%及31.59%。用Western blot方法测定GSTπ蛋白表达水平,DLJ14可以显著减少K562／A02及K562细胞中GSTπ蛋白表达。同时用Realtime-PCR检测GSTπ基因表达mRNA水平,经2.5 gmol／LDLJ14处理K562／A02及K562细胞72h后,可显著降低细胞内GSTπ基因mRNA水平,结果具有统计学差异。单用DLJ14(2.5,20μmol／L)处理K562／A02及K562细胞72h后,测定细胞内JNK及p-JNK表达,各组中JNK蛋白表达水平无明显差异,而20μmol／L DLJ14可以略微增加p-JNK的表达。将DLJ14(2.5,20μmol／L)与Adr(10合用处理K562／A02及K562细胞72h后,测定其中的p-JNK表达,各组中p-JNK蛋白表达水平明显增加。本课题筛选出了具有良好逆转活性的川芎嗪茋类衍生物DLJ14,它可通过抑制P-gp功能和调节GSTπ相关通路增加阿霉素的细胞毒性作用,从而达到逆转多药耐药的目的。川芎嗪茋类衍生物DLJ14可能成为肿瘤多药耐药逆转剂之一,具有深入研究的价值。