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背景纳米微泡可使组织增强显影,还可在超声辐照下定向释放所携载的药物和基因,为解决肾癌鉴别诊断和治疗所面临的困难提供了可能。鉴于肾癌相关抗原G250是一种膜蛋白,在绝大多数肾癌高表达而正常肾组织不表达,故可作为纳米微泡的靶点。同时,纳米抗体体积小、特异性强,作为配体有助于实现靶向纳米微泡的小型化。目的通过免疫骆驼制备能与肾癌相关抗原G250蛋白胞外区特异性结合的纳米抗体,将其与纳米微泡连接制备靶向纳米微泡,验证其肾癌靶向性,为下一步开展肾癌的鉴别诊断及靶向治疗提供研究基础。方法通过瞬时转染方式将包含G250蛋白胞外区基因片段的质粒导入到真核细胞HEK293F中表达G250胞外区,以该重组蛋白免疫新疆双峰驼,构建噬菌体展示纳米抗体库。通过体外定向筛选,得到能与G250蛋白胞外区特异性结合的噬菌体,以Monoclonal phage ELISA方法筛选出具有结合活性的噬菌体克隆。通过细胞ELISA和流式细胞实验再次验证淘选到的纳米抗体的细胞结合活性。制备空白纳米微泡,采用生物素-亲和素技术将G250纳米抗体连接于纳米微泡之上。通过免疫荧光验证靶向纳米微泡构建是否成功。流式细胞实验鉴定786-O、He La和ACHN三种细胞G250抗原表达情况;通过观察纳米微泡与细胞的结合情况评估纳米微泡的靶向性。结果通过测序证实编码G250的重组DNA片段序列正确,Western blot实验证实G250重组蛋白成功表达。通过免疫新疆双峰驼,成功构建了库容为2.87×109的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库。在体外对免疫纳米抗体库进行了3轮固相筛选,使具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集,阳性率高达54.3%。经过抗原ELISA、细胞ELISA鉴定,筛选出3个具有细胞结合活性的纳米抗体噬菌体克隆,取其中结合活性最高的Nb-G5进行表达、纯化,产量为1.5mg每升培养物。流式细胞实验证实Nb-G5对G250表达阳性的细胞具有很强的特异性结合能力。免疫荧光结果表明靶向纳米微泡构建成功,细胞靶向结合实验证实靶向纳米微泡能够与786-O细胞、He La细胞结合,不能与ACHN细胞结合,空白纳米微泡与786-O细胞、He La细胞、ACHN细胞均不结合。结论从纳米抗体库中淘选得到的纳米抗体在分子和细胞水平均能与G250蛋白胞外区特异性结合,成功构建了G250纳米抗体靶向的纳米微泡,并证实了其对于肾癌的靶向性。