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[目的] 利用异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导建立斑马鱼胚胎慢性心衰模型,通过采集和测算斑马鱼胚胎的心率、心脏室腔收缩面积、心肌细胞形态、细胞凋亡情况等实验参数,建立斑马鱼心衰模型的标准,从而为心衰研究以及药物筛选提供可靠的模型,并为临床提供理论基础和实验依据。 [方法] 首先探索ISO药浴诱导斑马鱼心衰的相对最适浓度和药浴时间,对斑马鱼胚胎行相应造模处理。将胚胎剥膜后选取无损伤的斑马鱼胚胎并随机分成两组(处理组和对照组)。在胚胎受精后(hour post fertilization,hpf)24、30、36、48、54小时(即24、30、36、48、54 hpf的胚胎)进行药浴液更换,并随机采集48、54、57、72 hpf各时间点每组斑马鱼心率和死亡情况。对72 hpf的各组斑马鱼行心脏搏动视频采集、原位杂交处理及免疫荧光实验,以估算心脏射血分数、比较心脏形态变化、心肌细胞形态及caspase3蛋白表达情况。 [结果] 1.心率及心脏表型: 心率情况:①采用两日五次加药用浓度为0.02 mg/ml的ISO处理的斑马鱼其心率在48 hpf、54 hpf、57 hpf与对照组相比均有所下降,72 hpf采集心率为71.2±14.7,对照组为196.8±7.5。且与对照组比较处理组心率显著低于对照组,具有统计学意义(P<0.01)。 镜下观察心脏表型情况:各浓度组(0.02、0 mg/ml)72 hpf时心包水肿率为:38.9%、26.7%。 2.心功能:利用相关软件分析斑马鱼心脏跳动视频,得到收缩末期与舒张末期的面积值,其差值除以舒张末期值便是一个心动周期的射血分数的估计值,而经结果分析发现处理组射血分数较对照组降低了32.5%,具有统计学意义(P<0.05)。 3.心房、心室形态大小:原位杂交染色后光镜下取腹部正位面观察:①72 hpf期斑马鱼心房形态大小情况:与对照组比较:0.02mg/ml处理组心房形态大小无明显改变,无统计学意义(P>0.05)。②72 hpf期斑马鱼心室形态大小情况:与对照组比较:0.02mg/ml处理组心室形态大小明显变大,具有统计学意义(P<0.05)。 4.心肌细胞形态大小及数目情况: 整体免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜下观察心肌细胞形态大小情况:①处理组72 hpf时期斑马鱼胚胎其心室心肌细胞形态大小与对照组比较无明显差别。②心房心肌细胞形态大小未予观察。 激光共聚焦显微镜下观察心肌细胞数目变化情况:①处理组72 hpf时期斑马鱼胚胎其心室心肌细胞数目,与对照组比较:无明显减少,无统计学意义(P>0.05)②心房心肌细胞数目未予观察统计。 5.整体免疫荧光检测心肌细胞Caspase-3蛋白的表达情况:①处理组72 hpf时期斑马鱼胚胎其心室心肌细胞Caspase-3蛋白的表达,与对照组相比较:有显著增加,具有统计学意义(P<0.05)②心房心肌细胞Caspase-3蛋白的表达情况未予观察统计。 [结论] 1.原位杂交染色心脏面积测算结果表明处理组心室较对照组增大,而心房之间无明显差异,提示ISO可能对斑马鱼胚胎的心室影响效应更大。 2.对ISO诱导下斑马鱼胚胎的各项相关指标分析,提示心衰模型实验取得初步成功。