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禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）可引发局部和全身感染,造成雏鸡大量死亡,给家禽业造成巨大的经济损失。Ⅰ型菌毛（Type 1Fimbriae）是APEC黏附相关毒力因子,可协助细菌在物体或宿主表面分泌粘附素,从而黏附、入侵宿主细胞。在APEC感染初始阶段,APEC通过Ⅰ型菌毛黏附宿主细胞实现定植后,会进一步形成生物被膜,导致APEC持续性和慢性感染。Ⅰ型菌毛由操纵子编码,主要由亚基Fim A、Fim B、FimC、Fim D、Fim E、Fim F、Fim G和Fim H构成。其中,FimC是一种由两个免疫球蛋白样结构域组成的周质伴侣（组装因子）,可协助菌毛亚基进行正确折叠,确保Ⅰ型菌毛正确组装;探究菌毛伴侣蛋白FimC对APEC初始感染黏附和侵袭分子机制尤为重要。但是FimC在APEC初始黏附和生物被膜形成过程中的作用和调控机制尚不明确。因此,本研究以Ⅰ型菌毛伴侣蛋白FimC为研究对象,拟构建fimC的缺失株,分析比较fimC缺失株和野生株之间的差异基因,筛选到潜在靶基因,通过生物学特性和诱导细胞损伤分析菌毛伴侣FimC与潜在基因之间的联系,揭示fimC和agn43之间的调控关系,为阐明Ⅰ型菌毛伴侣蛋白FimC对APEC生物学表型的调控机制提供理论依据。具体研究方法与结果如下:1.APEC的fimC基因功能验证及其调控下游靶基因的筛选本研究以禽致病性大肠杆菌APEC81的Ⅰ型菌毛伴侣蛋白fimC基因为研究对象,利用λ-Red同源重组技术,成功构建fimC的APEC81缺失株APEC81ΔfimC,并且通过质粒p STV28构建回复株APEC81CΔfimC。透射电镜下观察发现:APEC81ΔfimC与野生株相比,细菌的菌毛显著减少;Ⅰ型菌毛分子开关处在关闭状态;出现由菌毛亚基伴侣蛋白FimC所介导的显著的自聚集现象。将野生株、fimC缺失株和回复株进行转录组测序分析,并经过荧光定量PCR的验证,结果表明在fimC缺失导致了自转运蛋白基因agn43转录水平的显著升高8倍,因此将agn43作为受FimC调控潜在的靶基因进行后续研究。2.APEC的fimC及agn43基因对APEC生物学特性和诱导细胞损伤差异作用研究为探究fimC是否介导agn43来影响APEC的生物学表型及诱导细胞损伤差异,在APEC81中成功构建agn43的缺失株APEC81Δagn43和回复株APEC81CΔagn43,同时成功构建了fimC和agn43的双基因缺失株APEC81ΔfimCΔagn43和双回复株APEC81CΔfimCΔagn43。对APEC81、APEC81ΔfimC、APEC81CΔfimC、APEC81Δagn43、APEC81CΔagn43、APEC81ΔfimCΔagn43、APEC81CΔfimCΔagn43的生长、生物被膜形成能力、运动性、自聚集能力进行测定,同时进行了细胞黏附、入侵试验。结果显示,与野生株相比,APEC81ΔfimC自聚集能力显著增强（p＜0.0001）,生物被膜形成能力显著减弱（p＜0.0001）,运动能力显著增强（p＜0.0001）,对于HD-11细胞的黏附能力显著减弱（p＜0.0001）,入侵能力显著增强（P＜0.01）。双缺失株APEC81ΔfimCΔagn43与缺失株APEC81ΔfimC相比自聚集能力显著减弱（p＜0.01）,与野生株和缺失株APEC81Δagn43相比自聚集能力显著增强（p＜0.0001）;双缺失株APEC81ΔfimCΔagn43与缺失株APEC81ΔfimC相比生物被膜形成能力显著增强（p＜0.0001）,与野生株和缺失株APEC81Δagn43相比生物被膜形成能力显著减弱（p＜0.0001）;双缺失株APEC81ΔfimCΔagn43与缺失株APEC81ΔfimC相比运动能力显著减弱（p＜0.0001）,与野生株和缺失株APEC81Δagn43相比运动能力显著增强（p＜0.0001）;对于HD-11细胞的黏附能力,双基因缺失株APEC81ΔfimCΔagn43与两个单基因缺失株（APEC81ΔfimC和APEC81Δagn43）相比显著减弱（p＜0.0001）,而对于HD-11细胞的入侵能力无显著变化。通过以上结果,推测FimC和agn43之间存在调控关系。3.EMSA验证FimC结合agn43基因启动子区域为了进一步验证FimC和Ag43调控关系,通过β-半乳糖苷酶检测了agn43启动子的活性,并分段缺失agn43基因启动子区域（agn43Ⅰ、agn43Ⅱ和agn43Ⅲ）,通过荧光定量PCR验证其转录活性和调控关系。为了进一步确定两者是否为直接调控关系,通过构建了FimC蛋白的表达载体p ET28a-fimC,并进行FimC蛋白的诱导表达和纯化,同时构建并纯化探针进行EMSA实验验证FimC蛋白是否直接结合agn43基因启动子。结果显示APEC81ΔfimCΔagn43Ⅱ双缺失株Ag43转录水平下降了2倍,结果可以判定agn43Ⅱ是agn43基因启动子。EMSA的实验证明了FimC蛋白与agn43的启动子区域直接结合。以上研究结果表明,菌毛伴侣蛋白FimC的缺失可以引起APEC的自聚集现象,出现自聚集是由于自转运蛋白Ag43所介导的。FimC可以直接结合agn43的启动子区域,可负调控agn43的启动子,从而调控agn43的表达。本研究解析了Ⅰ型菌毛伴侣FimC负调控Ag43进而影响APEC黏附的分子机制,为阐明APEC致病机制并进一步实现对APEC的防控提供参考。