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研究目的:本研究主要探讨PHD锌指蛋白(PHF)14受缺氧诱导因子(HIF)1α诱导以及PHF14在马兜铃酸诱导的肾间质纤维化中的抑制效应及机制。方法:1.利用前期构建PHF14条件敲除小鼠,实验组小鼠基因型为phf14 flox/flox Cre+,同龄基因型为phf14 flox/flox Cre-的小鼠为对照组。在8-12周龄时,予以他莫西芬连续5天腹腔注射敲除PHF14,确认实验组小鼠PHF14成功敲除后,马兜铃酸(3mg/kg体重)腹腔注射3周(每3天一次)诱导肾纤维化。6周后处死小鼠,留取肾组织行Masson染色及免疫组化检测型胶原(Col)、α平滑肌肌动蛋白(α-sma),用Western blot、Real time PCR分别检测PHF14、Col、α-sma、结缔组织生长因子(CTGF)表达,留血液标本检测肌酐、尿素氮。2.大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)予以HIF脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG刺激,使细胞内HIF-1α升高,另一组同时加入HIF-1α抑制剂KC7F2,抑制HIF-1α表达及入核,使用Western blot、Real time PCR检测不同时间点(0,1,3,6h)HIF-1α、PHF14和CTGF变化。3.在NRK-52E细胞中,利用染色质免疫共沉淀的方法,检测HIF-1α是否可分别结合在PHF14与CTGF启动子区域。4.利用siRNA技术干扰NRK-52E细胞中PHF14表达,给予DMOG升高细胞内HIF-1α,通过Western blot、Real time PCR检测CTGF表达。5.在NRK-52E细胞中,应用染色质免疫共沉淀的方法明确PHF14是否可结合在CTGF的启动子区域。结果:1.机体在遭受马兜铃酸的纤维化刺激后,敲除PHF14的小鼠纤维化指标Col、α-sma表达较对照组明显升高。相比野生型小鼠,敲除组小鼠的肌酐、尿素氮的指标明显升高。2.在细胞水平上,使用DMOG刺激细胞后,PHF14、CTGF的表达也升高,而抑制HIF-1α入核后,PHF14、CTGF的表达增加被抑制。通过染色质免疫共沉淀的方法证明了HIF-1α可结合在PHF14和CTGF的启动子区域。3.在细胞水平上干扰PHF14表达后,使用DMOG刺激后CTGF的表达明显升高,通过染色质免疫共沉淀的方法证明PHF14可结合在CTGF的启动子区域。结论:在马兜铃酸诱导的肾纤维化小鼠中,敲除PHF14的小鼠纤维化表型更重,肾功能损害更严重。通过细胞水平的研究发现,PHF14和CTGF都可以被HIF-1α诱导,在干扰PHF14表达后CTGF的表达增加,通过染色质免疫共沉淀的方法证明PHF14可结合在CTGF的启动子区域。PHF14通过调控CTGF表达抑制了HIF-1α促纤维化作用的过度激活,本研究进一步阐述了PHF14在抑制纤维化进展中的重要作用。