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木质纤维素是地球上廉价且广泛存在的可再生资源,不仅可以通过生物和化学等方法获得各种可再生的生物基材料,而且可以通过微生物利用其水解物发酵生产高附加值化学品。木糖是木质纤维素水解液中含量第二的糖类,构建能高效利用及转运木糖的工业菌株是木质纤维素水解液进行生物炼制所必需的。谷氨酸棒杆菌由于具有一些独特的优点,是利用木糖进行发酵生产氨基酸等高附加值化学品的首先菌株。谷氨酸棒杆菌ATCC 13032不具备代谢木糖的能力。本研究通过构建木糖异构化途径,质粒表达不同来源的木糖异构酶基因xylA实现了对木糖的利用,其中大肠杆菌木糖异构酶效果最好。通过在基因组水平三拷贝表达来源于大肠杆菌MG 1655的木糖异构酶编码基因xylA,与pXMJ19过表达xylA基因的菌株在以木糖为唯一碳源的培养基中进行摇瓶验证,结果显示,随着xylA基因拷贝数的增加,菌体的终生物量逐渐增加,耗糖速率逐渐提升,从而确定xylA基因最优的表达强度为基因组水平三拷贝表达xylA基因,生物量达到质粒过表达水平,基因组水平表达比质粒过表达菌株具有更高的生长速率和更短的延滞期,终生物量(OD600)达到25±0.5,耗糖速率在15 h-24 h时达到6.4 g/(L·h-1)。基因组水平表达菌株的木糖代谢能力得到了良好的提升,即木糖异构酶的高表达有利于谷氨酸棒杆菌木糖代谢和菌体生长。为进一步强化谷氨酸棒杆菌的木糖代谢途径,本研究通过不同的手段对内源木酮糖激酶基因xylB进行了优化与表达。结果显示,敲除xylB的阻遏蛋白基因atlR后,菌株生长受到严重抑制,原因是xylB基因的过量表达导致木酮糖-5-磷酸的积累抑制了菌体生长;将来源于毕赤酵母的木酮糖激酶基因xyl3替换内源xylB基因或质粒过表达xyl3基因后,菌体生长未得到改善,且替换后的菌株生长受到明显抑制。为了促进木酮糖-5-磷酸的代谢,质粒过表达了xyl2和xyo基因,菌体生物量有少量提升。为了加强磷酸戊糖途径和糖酵解途径之间的连接,本研究采用PgapA启动子对tkt/tal操纵子基因进行了基因组第二拷贝表达,同时为了增加胞内辅酶的供给,基因组水平表达pntAB基因以增加NADPH的合成能力,表达nadK基因来增加NADP+的合成能力。摇瓶发酵结果显示通过增强转酮酶和转醛酶的活性以及增加辅酶表达量,菌体生长得到少量提升,OD600值分别增加了 1.0±0.4和2.0±0.4。对菌株木糖消耗和葡萄糖消耗做对比发现,胞外木糖消耗速率高于葡萄糖消耗速率,而葡萄糖和木糖共利用实验发现葡萄糖存在的条件下木糖消耗速率受到抑制。为了实现木糖和葡萄糖同步利用,本研究对谷氨酸棒杆菌葡萄糖和木糖转运系统进行了相关研究。通过基因敲除手段研究PTS系统各组分对葡萄糖和木糖运输的必要性,结果显示,ptsI和ptsH缺失后,菌体仅能在木糖培养基中生长,且最终生物量分别为7.0±0.5和8.0±0.5,在葡萄糖培养基中不生长;ptsG缺失后,菌株在葡萄糖培养基中不生长,在木糖培养基中生长变慢;EIIBCA全组分对运输木糖是必需的。对葡萄糖转运蛋白PtsG的两个磷酸化位点进行突变研究发现,两种单突变和双突变对木糖生长没有影响,说明PtsG运输木糖不需要经历磷酸化过程。该研究对深入理解谷氨酸棒杆菌木糖转运途径具有重要意义,同时为综合利用木质纤维素水解液为原料,通过发酵生产组氨酸、芳香族氨基酸及核苷类等产品奠定了坚实基础。