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目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对脾单个核细胞(mononuclearcell,MNC)体外活化及杀伤能力的影响,探讨MSCs的免疫调节活性及其作用机制,为MSCs应用于临床提供科学依据。方法:1利用全骨髓细胞贴壁培养法培养MSCs,倒置显微镜下观察细胞形态,并对第三代MSCs行瑞氏-吉姆萨染色,在倒置显微镜下观察染色后的细胞形态。用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测第三代MSCs表面标志性分子的表达及细胞周期分布。通过制作生长曲线和诱导MSCs向成脂肪、成骨方向分化,来研究MSCs的增殖特性和多向分化能力。2采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法研究不同比例MSCs(MSCs:MNC分别为1:20、1:10、1:2.5)对ConA刺激脾MNC增殖反应的抑制作用。3采用FCM检测在20μg/ml ConA刺激下,单独培养或与不同比例的MSCs(MSCs:MNC分别为1:20、1:10、1:2.5)共培养24h后,脾MNC细胞表面CD25的表达情况。4采用MTT法检测MSCs培养上清对脾MNC活化增殖能力的影响;用逆转录-聚合酶链式反应( revers transcription PCR,RT-PCR)和ELISA技术分别检测MSCs表达TGF-β1 mRNA的情况以及培养不同时间(24、48、72、96h)MSCs上清中TGF-β1的含量。5采用RT-PCR技术半定量检测在20μg/ml ConA刺激下,单独或与不同比例MSC(sMSCs:MNC分别为1:20、1:10、1:2.5)共培养72h后,脾MNC表达IL-2、IL-10以及IFN-γmRNA的水平。并用ELISA技术检测在20μg/ml ConA刺激下,单独培养和与不同比例MSCs(MSCs:MNC分别为1:20、1:10、1:2.5)共培养72h后,脾MNC培养上清中IL-2和IL-10的含量。6采用FCM检测在20μg/ml ConA刺激下,单独培养或与不同比例MSCs(MSCs:MNC分别为1:20、1:10、1:2.5)共培养72h后的脾MNC细胞周期分布以及凋亡情况;并用RT-PCR和FCM分别从mRNA和蛋白水平检测脾MNC表达p27和cyclin E的情况。7采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测在10μg/ml ConA刺激下,单独培养或与MSCs共培养48h后,脾MNC对肿瘤细胞的杀伤能力。采用FCM分析单独或与MSCs共培养48h后,脾MNC中CD4+CD25+T细胞亚群的比例;并用RT-PCR技术半定量分析其Foxp3 mRNA表达量的差异。采用ELISA技术检测在10μg/ml ConA刺激下,单独培养或与MSCs共培养48h后,MNC在24h内分泌TGF-β1和IL-10的水平。结果:1原代培养的MSCs是一种形态类似成纤维样的梭型细胞,首次传代时间为8-11天,传代后4-5天左右即可再次传代。FCM结果显示,第三代MSCs表达CD105、CD44、CD29,但不表达CD34和CD45。细胞周期检测结果显示,第三代MSCs绝大多数处于G0/G1期。体外应用相应的诱导体系,可使大鼠MSCs向成骨、成脂肪方向分化。2 MSCs能够显著抑制ConA刺激的脾MNC增殖反应,与MSCs共培养的脾MNC,其刺激指数明显低于单独培养组(P<0.01),而且这种抑制作用随MSCs比例的增加而增强。3 FCM检测结果显示,MSCs能够显著抑制活化脾MNC表达CD25,在20μg/ml ConA刺激下,与MSCs共培养24h后的脾MNC表达CD25的水平明显低于脾MNC单独培养组(P<0.01),而且这种抑制作用随MSCs比例的增加而增强。4 MSCs的培养上清也能够抑制ConA刺激的脾MNC体外活化(P<0.05),占培养体系总体积35%和70%的MSCs培养上清对脾MNC增殖的抑制率分别为13.32±2.10%和29.87±5.39%。RT-PCR和ELISA检测结果均显示MSCs表达较高水平的TGF-β1。5在20μg/ml ConA刺激下,与MSCs共培养72h后的脾MNC表达IL-2和IFN-γmRNA的水平明显低于脾MNC单独培养的对照组(P<0.05),但表达IL-10 mRNA的水平明显高于对照组(P<0.05)。ELISA实验结果显示,在20μg/ml ConA刺激下,与不同数量MSCs共培养72h后的脾MNC,其培养体系中IL-2的含量明显低于脾MNC单独培养的对照组(P<0.01),而IL-10的含量明显高于对照组(P<0.01)。6在20μg/ml ConA刺激下,MSCs可以使脾MNC被阻滞于G0/G1期,抑制其进入S期。随着MSCs比例的增加,阻滞于G0/G1期的MNC比例越来越高,而进入S期的MNC明显减少,与脾MNC单独培养的对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示,MSCs可以使脾MNC表达p27 mRNA的水平明显上调,表达cyclin E mRNA的水平明显下降,和对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测p27和cyclin E蛋白表达水平的结果与RT-PCR结果相一致。7 FCM检测的结果显示,在20μg/ml ConA刺激72h后,脾MNC单独培养组的凋亡率为19.24±1.94%。当MSCs与脾MNC以1:20共培养时,凋亡率为17.65±2.58%,与单独培养组相比,P>0.05没有明显差异。当MSCs与MNC以1:10和1:2.5共培养时,凋亡率分别为13.79±1.16%、10.34±1.26%均明显低于单独培养组(P<0.01)。8和单独培养组相比,与MSCs共培养48h后的脾MNC,杀伤肿瘤细胞能力明显下降(P<0.05);脾MNC中CD4+CD25+ T细胞亚群的比例和Foxp3 mRNA的表达量明显增高(P<0.01);脾MNC于24h内分泌TGF-β1和IL-10的水平明显高于单独培养组(P<0.01)。结论:1利用全骨髓细胞贴壁培养法可以从SD大鼠骨髓中扩增出一定数量、且纯度较高的MSCs,其生物学特性与干细胞相符。2 MSCs能够明显抑制脾MNC的增殖反应,而且这种抑制作用具有明显的量效依赖关系。3 MSCs对脾MNC免疫调节作用的机制有多个方面:(1)MSCs分泌的TGF-β1可能在其发挥免疫抑制功能中起一定作用。(2)MSCs对脾MNC的免疫调节作用可能与MSCs抑制MNC表达IL-2和IFN-γ,促进MNC表达免疫抑制性细胞因子IL-10有关。(3)MSCs对脾MNC的免疫调节作用可能与MSCs能够上调MNC表达p27的水平,下调MNC表达cyclin E的水平,从而使MNC阻滞于G0/G1期有关。4 MSCs对脾MNC免疫调节作用的机制与诱导MNC凋亡无明显相关。5与MSCs共培养后的脾MNC杀伤肿瘤细胞的作用明显减弱,其机制可能与MSCs能够改变MNC亚群组成,促进MNC表达免疫抑制性细胞因子有关。