【摘 要】
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裂解酶为噬菌体感染宿主后表达释放的一类细胞壁水解酶,通过水解细胞壁肽聚糖而使细菌裂解,并释放出子代噬菌体。噬菌体裂解酶能高效、专一地裂解细菌,使其有望取代传统的抗生素治疗,特别是对多重耐药性致病菌。本文以腾冲热海栖热菌噬菌体TSP4为材料,对高温噬菌体裂解酶进行了相关研究。来自TSP4的裂解酶TSPpgh基因大小为501bp,GC含量为57.09%;同源比对分析表明TSPpgh与来自栖热菌噬菌体的
【基金项目】
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国家自然科学基金项目:“腾冲热海栖热菌高温噬菌体基因组比较及重要功能蛋白的热稳定性分析”（30960022）；
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裂解酶为噬菌体感染宿主后表达释放的一类细胞壁水解酶,通过水解细胞壁肽聚糖而使细菌裂解,并释放出子代噬菌体。噬菌体裂解酶能高效、专一地裂解细菌,使其有望取代传统的抗生素治疗,特别是对多重耐药性致病菌。本文以腾冲热海栖热菌噬菌体TSP4为材料,对高温噬菌体裂解酶进行了相关研究。来自TSP4的裂解酶TSPpgh基因大小为501bp,GC含量为57.09%;同源比对分析表明TSPpgh与来自栖热菌噬菌体的肽聚糖水解酶具有较高同源性;保守结构域表明,TSPpgh属于M23肽酶家族。将编码TSPpgh的基因通过PCR扩增、连接、转化后得到重组表达菌pET28a-TSPpgh/BL21,重组蛋白在28℃、终浓度为1mM IPTG诱导表达4h可溶性表达量达到最大,重组蛋白分子量为21KDa。通过TSPpgh对不同细菌的抑菌实验发现,重组蛋白TSPpgh对其宿主菌TC16有明显的抑菌作用,对耐热芽孢杆菌NC8菌株和E.coli菌株也有一定的抑制作用。该重组蛋白TSPpgh最适酶活温度为66.5℃,从40到80℃均有酶活,高于大部分已报道的噬菌体裂解酶的最适作用温度;其在pH7-8时活性最强;金属离子对酶的影响研究结果显示,Na+,Zn2+这两种离子对TSPpgh活性影响不大,Mn2+,Fe2+存在时导致TSPpgh酶活性降低,而Mg2+对酶有激活作用。TSPpgh的显著特征在分子量小、具有高温催化活性及能从抑制革兰氏阳性和阴性细菌的生长。TSPpgh的显著特征在与其分子量小、具有高温催化活性及能从抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。结合TSPpgh的蛋白氨基酸熵值分析,对TSPpgh进行改造,设计了 2个蛋白质熵值分别升高和降低的突变体,通过比较获得突变体重组蛋白TSPpgh1与重组蛋白TSPpgh在不同温度下剩余酶活,发现突变体重组蛋白TSPpgh1热稳定性变差,这与其突变后蛋白氨基酸熵值升高有关,这为探索蛋白质热稳定性与其熵值的关系奠定了一定的基础。
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