第一部分野百合碱复合左肺切除诱发的大鼠肺动脉结构重建病理形态学观察 目的:观察野百合碱(MCT)复合单肺切除诱发的实验性肺动脉重建的病理形态学特征。 方法:16只雄性Lewis大鼠随机分为二组(n=8)：野百合碱+左肺切除组(M+P组)，大鼠行左肺切除，7天后皮下注射野百合碱(monocrotaline，MCT)60mg/kg；对照组(CON组)，大鼠仅行假手术处理。大鼠于左肺切除复合MCT皮下注射后28天检测肺动脉压、右心室重量，同时观察右肺动脉病理形态学改变。通过计算肌型、部分肌型肺小动脉在直径为15-50μm的外周肺小动脉中所占的比例评价其肌型化程度。以光镜下每1mm2面积内Ⅷ因子标记阳性的直径小于100μm的肺血管数评价肺内微血管密度。肺血管内皮凋亡通过Caspase-3免疫标记来进行检测。 结果:与对照组相比，M+P组大鼠肺动脉压力和RV/(LV+S)比值明显增高(P＜0.01)。病理观察显示M+P组大鼠MCT注射后28天肌型肺小动脉中膜明显增厚，肺腺泡内小动脉明显肌化、内膜增厚，对照组大鼠肺小动脉未见血管结构重建。与对照组相比，M+P组大鼠肺内肌型、部分肌型肺小动脉在直径为15-50μm的外周肺小动脉中所占的比例增加了4倍以上，VOS评分显示肺小动脉内膜明显增厚(P＜0.01)。与对照组相比，M+P组大鼠肺小动脉内皮细胞坏死及内弹力膜断裂明显。免疫组织化学显示M+P组大鼠肺小动脉内皮caspase-3呈强阳性表达，对照组肺小动脉内皮caspase-3则呈弱阳性表达。结论肺微血管密度减少、肺小动脉内皮损伤、肌型肺小动脉中膜增厚和肺腺泡内小动脉肌化、内膜增厚是野百合碱复合左肺切除诱发的大鼠肺动脉高压形成的病理基础。 第二部分野百合碱复合左肺切除诱发的肺动脉高压大鼠模型肺内肝细胞生长因子及其受体的表达 目的:观察野百合碱复合单肺切除诱发的肺动脉高压大鼠肺内肝细胞生长因子及其受体的表达。 方法:80只雄性Lewis大鼠随机分为2组(n=40)，每组再随机分为4个时间点(n=10)。野百合碱+左肺切除组(M+P组)大鼠行左肺切除，7天后皮下注射野百合碱；对照组(CON组)仅行假手术处理。各组动物分别于手术后14、21、28、35天行肺动脉压、心室重量检测，肺动脉病理形态学观察，RT-PCR法检测肺组织HGF、c-Met、eNOS表达水平，免疫印迹法检测肺组织HGF、c-Met表达水平，ELISA法检测肺组织ET-1、TGF-β含量，免疫组织化学法检测肺内eNOS和Ⅷ因子表达。 结果:与对照组大鼠相比，M+P组大鼠左肺切除复合野百合碱皮下注射后28天发生了明显的肺动脉高压和右室肥厚，伴肺动脉中膜明显肥厚、肺小动脉肌化。与对照组相比，M+P组大鼠肺组织HGFmRNA及其蛋白表达水平呈时间依赖性明显下调(P均＜0.01)。但两组大鼠肺组织c-MetmRNA及其蛋白表达各时间点均无明显差异(P均＞0.05)。RT-PCR和免疫组织化学检测结果显示M+P组大鼠肺内eNOS表达水平明显下调，与对照组相比有显著差异(P＜0.01)。ELlSA检测结果显示M+P组大鼠肺组织TGF-β和ET-1含量明显升高，并呈时间依赖性，对照组大鼠未见改变(P均＜0.01)。相关分析显示，肺组织HGFmRNA表达水平分别与平均肺动脉压、RV/S+LV比值、50-100μm和100-150μm肌型肺动脉中膜相对厚度、肺组织TGF-β、ET-1含量呈显著负相关关系(P均＜0.01)，与肺内eNOSmRNA表达水平、肺血管密度改变存在显著正相关(r=0.90938，P＜0.01；r=0.843，P＜0.01)。 结论:肺内HGF表达下调可能在野百合碱复合单肺切除诱导的大鼠肺血管重建中起重要作用；肺内HGF的表达下调与肺内eNOS的表达上调、ET-1表达的下调密切相关，可能在促进肺动脉高压大鼠肺血管内皮功能紊乱的发生中起重要作用。肺动脉高压时肺内TGF-β合成的增加可能是导致肺内HGF表达下调的重要原因。 第三部分骨髓间充质干细胞介导的大鼠肺内基因转移试验一Lewis大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定 目的:用Percoll分离液密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法分离和培养大鼠的骨髓间充质干细胞，并对分离、培养的间充质干细胞进行鉴定。 方法:采用Percoll分离液(1.073g/L)密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法来分离培养Lewis大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)。MSCs细胞鉴定：差相显微镜观察MSCs的形态学特征；流式细胞仪检测细胞表面标记抗原CD29、CD90、CD34和CD45的表达率；苏丹Ⅲ染色检测MSCs成脂细胞分化；碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测MSCs成骨分化。 结果:(略）。 　　结论:采用Percoll分离液(1.073g/L)密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法能够成功分离和培养大鼠的骨髓间充质干细胞。第5代骨髓间充质干细胞细胞保持分化潜能。 试验二骨髓间充质干细胞介导的大鼠肺内基因转移 目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)介导的大鼠肺内β-半乳糖苷酶(lacZ)基因转移并在肺内表达外源基因的可行性。 方法:对原代培养的Lewis大鼠骨髓间充质干细胞进行DAPI荧光染色标记或者转染β-半乳糖苷酶表达载体(pSV-bGal)，再将转染后或者荧光标记的MSCs(5×105细胞/每只大鼠)经颈静脉输入同基因背景的受体Lewis鼠体内(n=10)，48h和8w后处死大鼠(每时点5只大鼠)，切取大鼠肺脏、脾脏、肝脏、肾脏、骨骼肌标本，荧光显微镜观察荧光标记的移植细胞，将肺组织与X-gal色素原一起孵育检测Lac-Z基因的表达产物。 结果:静脉输入细胞后48h及8周，脾脏、胰、肝脏、肾脏、仅见少量荧光标记的MSCs，骨骼肌未见荧光标记的MSCs，但肺内可检测到大量荧光标记的MSCs，大部分的这些细胞主要位于肺间质和肺泡腔内。经颈静脉输入转染了pSV-bGal的MSCs后48h及8w，肺组织标本与X-gal色素原溶液一起孵育后，显微镜下可见大鼠肺内散布着许多深蓝色标记的MSCs细胞，相反，脾脏、肾脏中则仅见少量深蓝色标记的MSC细胞，肝脏、骨骼肌、胰腺组织未见深蓝色标记的MSC细胞。 结论:基于骨髓间充质干细胞的间接基因转移是一种有效的可选择性的在肺内转移外源基因的非病毒学方法。 第四部分骨髓间充质干细胞介导的人肝细胞生长因子基因转移对大鼠实验性肺动脉高压的影响研究 背景:(略） 方法:选择7周龄雄性Lewis大鼠行左肺切除术，1周后皮下注射野百合碱，同时经颈外静脉注射3×105个经过基因转染的骨髓间充质干细胞(MSCs)。16只Lewis大鼠随机分为2组(每组8只)。HGF组大鼠经颈外静脉注射转染了pUC-SR/HGF表达载体的MSCs。对照组(CON组)大鼠经颈外静脉注射转染了pUC-SRα表达载体的MSCs。细胞移植后28天分别进行肺动脉压、心室重量检测和肺动脉病理形态学观察。肺组织大鼠HGF(rHGF)、人HGF(hHGF)、c-Met、eNOS表达水平采用RT-PCR法进行检测，肺组织rHGF、hHGF、c-Met蛋白表达水平采用免疫印迹法(Westernblot)检测，c-Met蛋白磷酸化采用免疫共沉淀法检测，肺组织ET-1、TGF-β、hHGF含量采用ELISA法检测，肺内caspase-3和Ⅷ因子表达采用免疫组织化学法检测。 结果:与对照组相比，HGF组模型大鼠注射经pUC-SR/HGF转染的MSCs细胞后28天，肺动脉压、右室肥厚、肺动脉中膜肥厚、外周肺小动脉肌化明显减轻，其肺动脉内膜增厚(血管阻塞评分)也明显轻于对照组(P均＜0.01)。与对照组相比，HGF组肺内毛细血管密度(Ⅷ因子标记阳性的毛细血管数/mm2)显著增加(P＜0.01)。RT-PCR和Westernblot结果显示HGF组大鼠肺内rHGFmRNA及其蛋白表达水平均明显升高，与对照组相比有显著差异(P均＜0.01)。同样，HGF组eNOSmRNA及其蛋白表达水平也明显高于对照组(P均＜0.01)。HGF组大鼠细胞移植后28天可检测到肺内hHGFmRNA及其蛋白的明显表达，与之相比，对照组大鼠在细胞移植后未能检测到hHGFmRNA及其蛋白的表达(P均＜0.01)。ELISA检测结果显示HGF组大鼠肺组织TGF-β和ET-1的含量明显低于对照组大鼠(P均＜0.01)。免疫组织化学检测结果显示HGF组大鼠肺内caspase-3表达水平明显低于对照组大鼠。 结论:基于骨髓间充质干细胞的肺内HGF基因转移能够有效防止野百合复合单肺切除诱发的肺动脉高压的发生和发展。