研究背景与目的静脉畸形（venous malformations,VM）是先天性血管发育异常中最常见的一种,病理表现为扩张变形、迂曲成团的异常静脉组织,其血管平滑肌细胞数目减少,排列紊乱,随生长发育会逐渐扩张、迂曲成团。可发生于身体各个部位,其中口腔颌面、头颈及四肢是主要的发病部位。主要临床表现为肿胀、疼痛、出血、活动受限等,最终形成不可逆性功能障碍,若病变组织发生于重要功能部位或者器官部位时,将导致严重功能障碍或并发症状,从而造成严重后果乃至危及生命。近年来多项研究针对静脉畸形相关的致病性基因突变进行鉴定,并开始尝试阐明其发病的病理生理途径,研究表明静脉畸形的发生与TIE2（TEK）、PIK3CA、MEKK3等多种基因的突变均存在一定的相关性。静脉畸形有多种分类方式,其中按照遗传方式及发病特点可以主要分为散发性静脉畸形和家族遗传性静脉畸形,其中家族遗传性静脉畸形一般多灶起病、症状明显、病情严重,相关研究开展较早,多项研究均发现该类型患者体内存在相同的的基因突变基因TIE2突变,最常见的为TIE2-R849W——即TIE2基因第2545胞嘧啶突变为胸腺嘧啶（C＞T）,从而使其导致翻译对应的蛋白质细胞内第849位精氨酸突变为色氨酸,从而导致异常发病。而散发性静脉畸形的基因突变研究较少,中国尚无具体报道,对该病的分子遗传学研究还处于初期状态,对不同基因及位点的研究也缺乏一致性,其具体的发病机制研究尚不明确。因此散发性静脉畸形的致病机制的深入研究以及突变基因功能的探索,对于阐明静脉畸形的发病机制和新型靶向药物的研发具有重要意义。蛋白质组学技术是生命科学步入后基因时代重要标志性技术,为探索疾病特征及发病机理提供了新的手段。通常,基因功能的发挥都靠其编码的蛋白质得以表达,因此针对蛋白质的研究对于揭示生命体基因功能机制意义重大。目前,蛋白质组学的技术手段众多,基于质谱技术的蛋白质组学定量方法应用广泛,其中TMT（Tandem Mass Tags）蛋白质组学尤为突出。该技术通过质谱的串联作用对蛋白质进行差异鉴定和定量分析,其可以不依赖抗体、高效地对多种样品的多个目标进行同时操作。斑马鱼（Zebrafish,Danio rerio）已经成为一种重要的脊椎动物研究方向的生物发育学模型,在众多基因研究中发挥了不可忽视的作用,展现出了独特的分子学和组织学优势。斑马鱼的基因与人类基因同源性高达将近90%,并且基因的生物功能及作用上也具有高度的一致性;分子信号转导通路方式与人类基本相似;生理结构和生理功能也与哺乳动物高度相似;繁殖周期短,胚胎生长发育迅速,并且可以通过多种基因编辑技术制作转基因动物类型用于相关研究。在血管发育的动物模型研究领域,斑马鱼模型更是有着特殊的优势,其体内血管因存在特殊标记分子而在特定条件下可直观观察,运用转基因荧光标记技术后,斑马鱼体内血管可以在显微镜下被直接观察,从而能够直接且动态地观察早期血管的宏观发生、发展及成熟过程,其中胚胎期斑马鱼的尾静脉丛（caudal vein plexus,CVP）更是被认为研究早期静脉发育的最佳模型之一。本研究课题拟利用蛋白质组学及高内涵功能基因筛选（high-content screening,HCS）,筛选出散发型静脉畸形发病中发挥重要功能的关键功能基因,分析并探索其可能的生物学功能,进一步建立基因突变斑马鱼模型并初步探讨其在静脉畸形体内模型中的致病机制。研究方法1.标本收集:按照纳入及排除标准,取山东省立医院整形美容外科2019年至2020年散发性静脉畸形患者10例,收集手术切除的静脉畸形组织。对照组为10例正常组织。选取代表性的静脉畸形组织标本转移至液氮中保存,其余标本采用4%多聚甲醛固定,用于病理检测。随机选取其中3对进行蛋白质组学分析,其余标本进行后续验证实验。实验的整体研究经过了山东大学附属省立医院伦理委员会的审批通过,所有标本收集之前全部征得患者本人或者法定监护人的知情同意。2.TMT（Tandem Mass Tag）标记定量蛋白质组学分析:选取对照组和实验组3对组织,利用TMT标记定量蛋白质组学技术进行差异蛋白分析,比较静脉畸形与正常组织间的蛋白质差异,结果经t-检验分析选择差异倍（Fold Change,FC）≥1.4且P＜0.05视为有统计学差异。进一步对差异蛋白质集合进行GO（gene ontogy）分析,包括 biological process（BP）,molecular function（MF）和 Cellular compoment（CC）,探索目的蛋白功能。采用 KOALA KEGG Orthology And Links Annotation软件进行通路富集分析。3.利用高内涵筛选技术（High-content screening,HCS）得到差异显著的关键驱动基因:根据生信分析及文献查阅选取差异明显的20个蛋白质进行高内涵功能基因筛选,基于高内涵筛选（HCS）平台,建立可用于静脉畸形高内涵筛选的体外细胞模型—人微血管内皮细胞（HMEC-1）,根据蛋白质组学结果分别构建相应的20个基因的敲减及过表达细胞模型,在此基础上对20个待选基因进行高内涵筛选。得到增殖能力差异最为显著的关键驱动基因。4.分析目的基因在静脉畸形及正常组织中的表达水平:应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测目的基因在静脉畸形及正常组织中的的表达水平。5.目的基因初步功能研究:选择目的基因构建相应的过表达及RNAi慢病毒载体并转染人微血管内皮细胞（HMEC-1）,进一步使用qRT-PCR及蛋白免疫印记（Western bolt）对慢病毒转染效率进行检测。接下来目的基因对细胞的生物功能的作用进行探究,细胞增殖能力的变化通过CCK-8实验检测,细胞的迁移能力的变化通过OrisTM plate细胞划痕实验检测,通过侵袭实验检测细胞的侵袭能力变化,细胞生长周期的变化通过FACS细胞周期实来验检测,采用血管生成实验检测目的基因对血管生成的调控作用。6.构建ACTA2敲减的斑马鱼模型:利用morpholino技术,基于flila EGFP分子的转基因斑马鱼构建ACTA2敲减的斑马鱼模型,构建ATG-MO实验组、E2I2-MO实验组以及对照组。7.斑马鱼血管生成相关研究:荧光显微镜下记录斑马鱼背部节间血管（intersegmental vessels,ISVs）、尾静脉丛（caudal vein plexus,CVP）、后主静脉（posterior cardinal vein,PCV）、背侧纵向吻合血管（dorsal longitudinal anastomotic vessel,DLAV）的发育变化情况并进行定量化分析比较。8.提取斑马鱼RNA,通过qRT-PCR检测对照组及实验敲减组各通路相关分子的表达情况,尝试探究目的基因参与静脉畸形致病相关的机制。研究结果1.TMT蛋白质组学及生信分析结果:蛋白质组学结果显示共有71个蛋白质表达的差异符合要求,5个蛋白质表达上调,66个蛋白质表达下调（FC≥1.4,P＜0.05）。对差异蛋白进行生物信息学分析,发现众多功能部分与肌动蛋白相关,如Gene Ontology（GO）分析显示差异蛋白在生物过程方面主要体现在生物调节、细胞进程、细胞骨架组织的调节等,差异蛋白在分子功能方面的差异主要表现在肌动蛋白丝结合、分子传感器活性、生物结合等方面,在细胞成分主要表现在细胞质、细胞器、细胞部分等方面。其中细胞骨架调节、肌动蛋白丝结合等都与血管内皮细胞的功能以及血管平滑肌的形成密切相关,说明差异蛋白与血管形成过程可能存在密切联系。利用KAAS（KEGG Automatic Annotation Server）软件对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释,结果显示差异蛋白KEGG通路主要包括之一为肌动蛋白骨架调节通路。2.利用高内涵筛选表明ACTA2为静脉畸形关键的差异基因:根据生信结果及蛋白质组学差异倍数挑选5个高表达的和15个低表达的蛋白质基因（上调的有 CFHR2、MMP2、COMP、F7、CD248,下调的有 MAPK1、HSPA8、HSP90AA1、MMP9、ACTA2、YWHAB、HRG、TFPI、TFPI、ACTG1、ACTG1、GSTP1、GAPDH、GAPDH、S100A9）进行基因层面的RNAi技术功能学筛选实验,利用慢病毒分别构建过表达及敲减相应基因的细胞模型,细胞转染培养后于96孔板,对其进行检测计数。第一轮HCS结果显示:在待测的20个基因中,shACTA2组Fold change≥1.5,为本次实验筛选出的阳性基因（增殖抑制阳性细胞组）。第二轮对ACTA2基因进行HCS单靶点筛选,结果显示:3个敲减组均产生增殖抑制,ACTA2-RNAi（3487-4）、ACTA2-RNAi（3488-1）组 Fold change≥1.5,证明 ACTA2基因的差异性。3.采用RT-qPCR检测静脉畸形患者病理组织中和对照组组织中ACTA2基因的表达情况,实验结果显示静脉畸形组织中ACTA2存在显著低表达（P＜0.05）。4.过表达ACTA2对HMEC迁移、侵袭、增殖、细胞周期及血管生成能力造成明显影响:构建过表达ACTA2的HMEC-1,检测其细胞学功能。CCK-8实验结果证明在人微血管内皮细胞中过表达ACTA2会使细胞增能力明显升高;OrisTM plate细胞划痕实验结果表明在人微血管内皮细胞中过表达ACTA2后明显增加了其迁移能力;侵袭实验结果证明过表达ACTA2后人微血管内皮细胞细胞的侵袭能力明显增高;细胞周期实验显示在人微血管内皮细胞中过表达ACTA2后,细胞处于G1期的比例明显增多,处于S期的细胞明显减少、G2期的细胞增多,说明ACTA2基因影响了人微血管内皮细胞的正常细胞周期;体外血管生成实验显示过表达ACTA2后血管形成能力-血管的面积、长度、节点数、分枝数均明显升高,说明过表达ACTA2促进了体外血管生成。以上结果说明过表达ACTA2后人微血管内皮细胞的众多生物功能产生了明显的促进作用。5.构建ACTA2敲减的斑马鱼模型,发现敲减ACTA2引起斑马鱼血管发育缺陷、血管完整性破坏、静脉发育畸形:成功构建ACTA2敲减的静脉畸形的斑马鱼模型,观察其血管发育显示ACTA2敲减显著影响了斑马鱼早期尾静脉丛、节间静脉、背侧纵向吻合血管的发育,其具体表现为血管数量的显著减少、长度的缩短、以及形态的不规则发育导致的畸形。6.敲减ACTA2后Dll4-notch1信号通路、Ephrin-B2信号通路及血管完整性相关分子的表达受到抑制,Hedgehog信号通路被激活:通过qRT-PCR检测对照组及acta2敲减组各通路相关分子的表达情况,发现与D114-notch1信号通路、Ephrin-B2信号通路及 VE-PTP相关的 dll4,notch1a,notch1b,hey2,efnb2a,ptp-rb,cd146,nr2f1a,s1pr1 均明显降低。与 Hedgehog 信号通路相关的 shha,ptch2,Sufu,Glil,Gli2b表达明显升高。结论与意义1.本研究采用蛋白质组学及高内涵筛选技术首次发现ACTA2在静脉畸形中的关键作用,首次明确了 ACTA2为静脉畸形致病相关的关键基因,并在患者组织中进行了验证。显著差异表达提示其ACTA2的缺失可能在静脉畸形的发生、发展中具有重要作用。2.构建静脉畸形的体外细胞模型,证明了 ACTA2基因对于血管内皮细胞迁移、侵袭、增殖、细胞周期及血管生成能力造成明显影响,表明了 ACTA2有可能在静脉畸形发病过程中导致的血管内皮细胞增殖、血管生成、血管形态异常中起重要作用。3.成功构建了 ACTA2缺陷的斑马鱼模型,在体内实验中验证了 ACTA2对于静脉发育异常畸形的影响,为静脉畸形的诊疗提供了新的思路和靶点。4.首次在体内实验中发现ACTA2缺陷导致的静脉畸形可能与D114-notch1信号通路、Ephrin-B2信号通路、血管完整性以及Hedgehog信号通路密切相关,经过分析比较ACTA2敲减组及正常组的相关分子表达情况发现ACTA2的缺失可能是抑制下调了Dll4-notch1信号通路、Ephrin-B2信号通路及血管完整性相关分子的表达,而激活上调了 Hedgehog信号通路表达从而导致了血管完整性破坏、血管新生缺陷、静脉发育畸形,由于体内细胞信号通路之间的交叉对话机制非常复杂,具体机制还有待进一步研究。本研究对于静脉畸形的致病机制的深入研究提供了新的思路,对于靶向治疗靶点的选择提供了新的研究方向。