论文部分内容阅读
研究背景：
成体神经干细胞通常是以静息和激活两种可互相转换但截然不同的状态存在。神经干细胞静息/激活一旦失衡可能导致衰老和病理条件下神经再生的异常，造成脑机能减退、认知能力受损、神经退行性疾病以及肿瘤的发生。研究发现脑组织损伤后，静息的神经干细胞被大量激活，迅速增殖，以实现神经再生和维持正常脑功能。但过度的增殖，往往造成干细胞库的耗竭，导致神经再生能力的永久丧失。机体如何调控脑组织损伤后静息/激活之间的平衡，以维持干细胞库的稳态，保证持久的神经再生能力，促进组织损伤修复是目前研究的热点。有研究表明脑缺血损伤或病毒感染时内源性干扰素表达增加，诱导静息干细胞激活，促进干细胞增殖，实现组织损伤后修复；另一方面已证实骨形成蛋白(BMP)信号通路能够维持包括成体神经干细胞在内的多种干细胞静息，实现干细胞库的稳态。BMP在神经干细胞静息激活中发挥重要作用。抑制BMP信号通路可部分恢复老年小鼠神经干细胞增殖能力，促进神经再生，逆转衰老诱发的脑病变。Ⅰ型干扰素家族成员干扰素β(IFNβ)作为免疫调节细胞因子，在脑环境稳态维持、衰老和神经退行性疾病的调节中发挥重要作用。阻断脑内Ⅰ型干扰素信号通路可部分恢复老年小鼠海马神经再生，延缓DNA损伤产生的早衰现象，提示干扰素参与组织损伤后静息激活转换的调节。但目前关于IFNβ对神经干细胞静息激活的直接影响尚未见报道。而且证据表明BMP和IFNβ在组织损伤神经再生进程中可能存在某种关系，共同调节神经干细胞静息激活，维持正常的脑功能。但BMP和IFNβ之间如何相互作用，参与神经干细胞静息激活平衡的调节，实现脑组织损伤后神经再生，具体机制尚不清楚。
目的：
基于BMP和IFNβ在中枢神经系统发育、组织损伤和疾病中的动态表达与重要功能，我们将BMP和IFNβ信号通路对人源神经干细胞的作用及调控机理作为主要研究内容，解析神经干细胞如何感应并整合体内外环境因素的变化，统筹协同细胞代谢和周期的剧变，达到对静息激活的及时、精准的调控。通过本课题的研究，最终实现：
1.建立体外人源神经干细胞静息、可逆性激活和增殖分化过程的体外培养体系。我们已初步建立大鼠、小鼠神经干细胞静息激活体系，本实验将继续完善整个神经干细胞静息激活体系，将为干细胞静息激活和细胞周期研究提供更为可靠的研究模型，为干细胞命运决定的基因组学分析和系统生物学研究、高通量筛选和功能机制研究提供大量的细胞材料。
2.确定BMP4和IFNβ在神经干细胞静息激活转换中的协同调控作用，为解析控制成体干细胞静息激活动态平衡的分子网络系统打下良好的技术和理论基础。
3.探讨BMP信号通路和IFNβ信号通路之间在人源神经干细胞协同调控的机制，从而更好的认识成体神经再生以及脑组织损伤修复，为治疗中枢神经系统损伤性疾病提供新的思路和靶点。
方法：
1.人源神经干细胞静息-激活可逆体系建立和完善
从人源胚胎干细胞逐步诱导分化出人源神经干细胞。稳定传代后利用神经干细胞标记物SOX2、Nestin和分化标记物TuJ1和S100-beta免疫荧光染色鉴定神经干细胞增殖及多向分化潜能。利用BMP4和FGF不同配比处理人源神经干细胞，经增殖标记物ki67免疫荧光染色，结合Py/Hoechst染色后流式细胞技术，鉴定神经干细胞是否进入静息态。传代换液除去BMP4，通过Ki67免疫荧光染色和流式细胞检测其增殖能力和细胞周期改变，通过TuJ1和S100-beta免疫荧光染色鉴定细胞分化能m力，判断细胞是否被重新激活。从而确定人源神经干细胞静息-激活可逆体系建立。
2.IFNβ对人源神经干细胞增殖影响的研究
采用不同浓度IFNβ重组蛋白和FGF配比处理人源神经干细胞，通过Ki67免疫荧光染色检测其增殖能力；通过Py/Hoechst染色后流式细胞仪分析检测细胞周期的变化，从而确定IFNβ对人源神经干细胞增殖的影响。
3.IFNβ和BMP4双处理对人源神经干细胞增殖影响的研究
采用合适配比的IFNβ和BMP4处理人源神经干细胞，通过Ki67染色和Py/Hoechst染色后流式细胞技术分析细胞增殖状况、静息-激活状况及不同细胞周期的比例，确定IFNβ/BMP4双处理对人源神经干细胞增殖的影响。
4.IFNβ和BMP4协同调控作用的研究
利用BMP拮抗剂noggin和IFNAR1抗体处理人源神经干细胞，采用Ki67染色和PY/Hoechst染色后流式细胞技术分析细胞增殖状况、静息-激活状况及不同细胞周期的比例，观察noggin或IFNAR1抗体对IFNβ/BMP4双处理作用的影响，进一步明确IFNβ和BMP4协同调控作用。
5.转录组水平分析BMP和IFNβ协同调控作用的相关信号通路
收集不同时间点IFNβ和或BMP4处理的人源神经干细胞，采集各样本的总RNA，通过RNA-seq测序，分析总RNA中大部分转录组的表达情况，从转录组中寻找相关信号通路基因的表达情况。
利用Morpheus网站寻找差异基因，并将差异基因导入DAVID中KEGG数据库，对转录组数据进行聚类分析，得到上调或者下调基因所富集的信号通路，筛选P-value＜0.05的信号通路，即是在各种处理中起调控作用的信号通路。分析并比较不同处理组上调或下调的信号通路。
6.mRNA和蛋白水平验证分析
通过收集不同时间点IFNβ和/或BMP4处理的人源经干细胞样本，利用Real-timePCR技术和免疫印迹技术检测IFNβ信号通路相关基因的表达。
7.BMP信号通路和IFNβ信号通路协同调控作用机理分析
利用TopHat将测序所得片段比对到基因组上。利用Cufflinks计算基因的FPKM值。查询KEGG数据库、GeneOntology(GO)数据库以及文献，对这群基因的功能进行人工注释，发现这些基因所参与的通路、GO细胞定位、GO生物学过程、GO功能。从转录组水平初步探讨BMP通路和IFNβ信号通路之间的协同作用机理。
结果：
1.我们成功分离出具有多向分化潜能的人源神经干细胞。BMP4处理抑制人源神经干细胞增殖，导致细胞周期停滞在G0期。BMP4诱导细胞进入静息是可逆的。
2.IFNβ处理人源神经干细胞，加快细胞生长速度，进入分裂周期的细胞明显增多，增殖能力显著增强。
3.IFNβ和BMP4双处理人源神经干细胞，细胞数目显著减少，进入分裂周期的细胞明显减少，细胞增殖受到显著抑制。IFNβ和BMP4双因素处理呈现出和单因素不同的作用。
4.BMP拮抗剂noggin除拮抗了由BMP4引起的作用，还可阻止IFNβ/BMP4双处理对人源神经干细胞的抑制作用，细胞增殖能力显著提高。而IFNAR1抗体处理虽可拮抗IFNβ的作用，但不能阻止IFNβ/BMP4双处理对人源神经干细胞的抑制作用。
5.聚类分析发现BMP4组和IFNβ/BMP4组处理人源神经干细胞后引起基因的差异表达极为相似，而IFNβ/BMP4组与IFNβ组处理后引起基因的差异表达相似度不高。
6.转录组数据分析结果显示IFNβ/BMP4双处理后引起IFNβ信号通路大部分基因表达显著上调，幅度明显高于单独IFNβ处理，提示BMP4增强了IFNβ信号通路的反应；而IFNβ/BMP4双处理对BMP信号通路的基因表达水平影响不大，与BMP4单独处理无显著差异。
7.Real-timePCR技术进一步验证RNA-seq结果，发现处理1.5小时后IFNβ信号通路基因表达开始有变化，处理24小时响应最显著。其中IFNβ/BMP4双处理组IFNβ信号通路相关基因STAT1、ISG15、IFIT1、IFIH1、IRF7表达明显升高，升高幅度显著高于IFNβ单处理组，与测序结果一致。利用westernblot进行蛋白水平的检测显示IFNβ/BMP4双处理后IFNβ信号通路中的关键基因STAT1蛋白表达增加，与测序结果及Real-timePCR结果一致。
8.从整体基因组水平进行宏观分析，筛选出一群IFNβ/BMP4双处理后表达显著高于IFNβ或BMP4单处理的基因，发现干扰素信号通路、防御反应免疫应答通路、细胞增殖/分化/锚定/迁移/细胞周期相关的信号通路、凋亡信号分子、DNA重塑/解螺旋酶、DNA聚合酶polⅡ参与的mRNA转录调控等10个通路在这群基因中显著富集，提示这些通路可能是IFNβ/BMP4双处理抑制人源神经干细胞作用的分子基础。
结论：
1.我们成功建立了体外人源神经干细胞静息激活可逆体系。
2.BMP4诱导细胞静息；而IFNβ促进人源神经干细胞增殖。
3.IFNβ和BMP4双处理时，表现出对人源神经干细胞增殖的抑制。
4.BMP4增加IFNβ信号通路的反应性，改变人源神经干细胞对IFNβ的应答，发挥了较为复杂的调控作用。
5.干扰素响应信号通路、防御反应免疫应答通路、细胞增殖/分化/锚定/迁移/细胞周期相关的信号通路、凋亡信号分子、DNA重塑/解螺旋酶、DNA聚合酶polⅡ参与的mRNA转录调控等通路参与IFNβ/BMP4协同调控作用，可能是IFNβ/BMP4发挥作用的分子基础。
成体神经干细胞通常是以静息和激活两种可互相转换但截然不同的状态存在。神经干细胞静息/激活一旦失衡可能导致衰老和病理条件下神经再生的异常，造成脑机能减退、认知能力受损、神经退行性疾病以及肿瘤的发生。研究发现脑组织损伤后，静息的神经干细胞被大量激活，迅速增殖，以实现神经再生和维持正常脑功能。但过度的增殖，往往造成干细胞库的耗竭，导致神经再生能力的永久丧失。机体如何调控脑组织损伤后静息/激活之间的平衡，以维持干细胞库的稳态，保证持久的神经再生能力，促进组织损伤修复是目前研究的热点。有研究表明脑缺血损伤或病毒感染时内源性干扰素表达增加，诱导静息干细胞激活，促进干细胞增殖，实现组织损伤后修复；另一方面已证实骨形成蛋白(BMP)信号通路能够维持包括成体神经干细胞在内的多种干细胞静息，实现干细胞库的稳态。BMP在神经干细胞静息激活中发挥重要作用。抑制BMP信号通路可部分恢复老年小鼠神经干细胞增殖能力，促进神经再生，逆转衰老诱发的脑病变。Ⅰ型干扰素家族成员干扰素β(IFNβ)作为免疫调节细胞因子，在脑环境稳态维持、衰老和神经退行性疾病的调节中发挥重要作用。阻断脑内Ⅰ型干扰素信号通路可部分恢复老年小鼠海马神经再生，延缓DNA损伤产生的早衰现象，提示干扰素参与组织损伤后静息激活转换的调节。但目前关于IFNβ对神经干细胞静息激活的直接影响尚未见报道。而且证据表明BMP和IFNβ在组织损伤神经再生进程中可能存在某种关系，共同调节神经干细胞静息激活，维持正常的脑功能。但BMP和IFNβ之间如何相互作用，参与神经干细胞静息激活平衡的调节，实现脑组织损伤后神经再生，具体机制尚不清楚。
目的：
基于BMP和IFNβ在中枢神经系统发育、组织损伤和疾病中的动态表达与重要功能，我们将BMP和IFNβ信号通路对人源神经干细胞的作用及调控机理作为主要研究内容，解析神经干细胞如何感应并整合体内外环境因素的变化，统筹协同细胞代谢和周期的剧变，达到对静息激活的及时、精准的调控。通过本课题的研究，最终实现：
1.建立体外人源神经干细胞静息、可逆性激活和增殖分化过程的体外培养体系。我们已初步建立大鼠、小鼠神经干细胞静息激活体系，本实验将继续完善整个神经干细胞静息激活体系，将为干细胞静息激活和细胞周期研究提供更为可靠的研究模型，为干细胞命运决定的基因组学分析和系统生物学研究、高通量筛选和功能机制研究提供大量的细胞材料。
2.确定BMP4和IFNβ在神经干细胞静息激活转换中的协同调控作用，为解析控制成体干细胞静息激活动态平衡的分子网络系统打下良好的技术和理论基础。
3.探讨BMP信号通路和IFNβ信号通路之间在人源神经干细胞协同调控的机制，从而更好的认识成体神经再生以及脑组织损伤修复，为治疗中枢神经系统损伤性疾病提供新的思路和靶点。
方法：
1.人源神经干细胞静息-激活可逆体系建立和完善
从人源胚胎干细胞逐步诱导分化出人源神经干细胞。稳定传代后利用神经干细胞标记物SOX2、Nestin和分化标记物TuJ1和S100-beta免疫荧光染色鉴定神经干细胞增殖及多向分化潜能。利用BMP4和FGF不同配比处理人源神经干细胞，经增殖标记物ki67免疫荧光染色，结合Py/Hoechst染色后流式细胞技术，鉴定神经干细胞是否进入静息态。传代换液除去BMP4，通过Ki67免疫荧光染色和流式细胞检测其增殖能力和细胞周期改变，通过TuJ1和S100-beta免疫荧光染色鉴定细胞分化能m力，判断细胞是否被重新激活。从而确定人源神经干细胞静息-激活可逆体系建立。
2.IFNβ对人源神经干细胞增殖影响的研究
采用不同浓度IFNβ重组蛋白和FGF配比处理人源神经干细胞，通过Ki67免疫荧光染色检测其增殖能力；通过Py/Hoechst染色后流式细胞仪分析检测细胞周期的变化，从而确定IFNβ对人源神经干细胞增殖的影响。
3.IFNβ和BMP4双处理对人源神经干细胞增殖影响的研究
采用合适配比的IFNβ和BMP4处理人源神经干细胞，通过Ki67染色和Py/Hoechst染色后流式细胞技术分析细胞增殖状况、静息-激活状况及不同细胞周期的比例，确定IFNβ/BMP4双处理对人源神经干细胞增殖的影响。
4.IFNβ和BMP4协同调控作用的研究
利用BMP拮抗剂noggin和IFNAR1抗体处理人源神经干细胞，采用Ki67染色和PY/Hoechst染色后流式细胞技术分析细胞增殖状况、静息-激活状况及不同细胞周期的比例，观察noggin或IFNAR1抗体对IFNβ/BMP4双处理作用的影响，进一步明确IFNβ和BMP4协同调控作用。
5.转录组水平分析BMP和IFNβ协同调控作用的相关信号通路
收集不同时间点IFNβ和或BMP4处理的人源神经干细胞，采集各样本的总RNA，通过RNA-seq测序，分析总RNA中大部分转录组的表达情况，从转录组中寻找相关信号通路基因的表达情况。
利用Morpheus网站寻找差异基因，并将差异基因导入DAVID中KEGG数据库，对转录组数据进行聚类分析，得到上调或者下调基因所富集的信号通路，筛选P-value＜0.05的信号通路，即是在各种处理中起调控作用的信号通路。分析并比较不同处理组上调或下调的信号通路。
6.mRNA和蛋白水平验证分析
通过收集不同时间点IFNβ和/或BMP4处理的人源经干细胞样本，利用Real-timePCR技术和免疫印迹技术检测IFNβ信号通路相关基因的表达。
7.BMP信号通路和IFNβ信号通路协同调控作用机理分析
利用TopHat将测序所得片段比对到基因组上。利用Cufflinks计算基因的FPKM值。查询KEGG数据库、GeneOntology(GO)数据库以及文献，对这群基因的功能进行人工注释，发现这些基因所参与的通路、GO细胞定位、GO生物学过程、GO功能。从转录组水平初步探讨BMP通路和IFNβ信号通路之间的协同作用机理。
结果：
1.我们成功分离出具有多向分化潜能的人源神经干细胞。BMP4处理抑制人源神经干细胞增殖，导致细胞周期停滞在G0期。BMP4诱导细胞进入静息是可逆的。
2.IFNβ处理人源神经干细胞，加快细胞生长速度，进入分裂周期的细胞明显增多，增殖能力显著增强。
3.IFNβ和BMP4双处理人源神经干细胞，细胞数目显著减少，进入分裂周期的细胞明显减少，细胞增殖受到显著抑制。IFNβ和BMP4双因素处理呈现出和单因素不同的作用。
4.BMP拮抗剂noggin除拮抗了由BMP4引起的作用，还可阻止IFNβ/BMP4双处理对人源神经干细胞的抑制作用，细胞增殖能力显著提高。而IFNAR1抗体处理虽可拮抗IFNβ的作用，但不能阻止IFNβ/BMP4双处理对人源神经干细胞的抑制作用。
5.聚类分析发现BMP4组和IFNβ/BMP4组处理人源神经干细胞后引起基因的差异表达极为相似，而IFNβ/BMP4组与IFNβ组处理后引起基因的差异表达相似度不高。
6.转录组数据分析结果显示IFNβ/BMP4双处理后引起IFNβ信号通路大部分基因表达显著上调，幅度明显高于单独IFNβ处理，提示BMP4增强了IFNβ信号通路的反应；而IFNβ/BMP4双处理对BMP信号通路的基因表达水平影响不大，与BMP4单独处理无显著差异。
7.Real-timePCR技术进一步验证RNA-seq结果，发现处理1.5小时后IFNβ信号通路基因表达开始有变化，处理24小时响应最显著。其中IFNβ/BMP4双处理组IFNβ信号通路相关基因STAT1、ISG15、IFIT1、IFIH1、IRF7表达明显升高，升高幅度显著高于IFNβ单处理组，与测序结果一致。利用westernblot进行蛋白水平的检测显示IFNβ/BMP4双处理后IFNβ信号通路中的关键基因STAT1蛋白表达增加，与测序结果及Real-timePCR结果一致。
8.从整体基因组水平进行宏观分析，筛选出一群IFNβ/BMP4双处理后表达显著高于IFNβ或BMP4单处理的基因，发现干扰素信号通路、防御反应免疫应答通路、细胞增殖/分化/锚定/迁移/细胞周期相关的信号通路、凋亡信号分子、DNA重塑/解螺旋酶、DNA聚合酶polⅡ参与的mRNA转录调控等10个通路在这群基因中显著富集，提示这些通路可能是IFNβ/BMP4双处理抑制人源神经干细胞作用的分子基础。
结论：
1.我们成功建立了体外人源神经干细胞静息激活可逆体系。
2.BMP4诱导细胞静息；而IFNβ促进人源神经干细胞增殖。
3.IFNβ和BMP4双处理时，表现出对人源神经干细胞增殖的抑制。
4.BMP4增加IFNβ信号通路的反应性，改变人源神经干细胞对IFNβ的应答，发挥了较为复杂的调控作用。
5.干扰素响应信号通路、防御反应免疫应答通路、细胞增殖/分化/锚定/迁移/细胞周期相关的信号通路、凋亡信号分子、DNA重塑/解螺旋酶、DNA聚合酶polⅡ参与的mRNA转录调控等通路参与IFNβ/BMP4协同调控作用，可能是IFNβ/BMP4发挥作用的分子基础。