酪丝亮肽对肝癌的治疗作用及影响肿瘤细胞信号传导的机理研究

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:lcsj652
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目的:研究三肽化合物酪丝亮肽(YSL)在体内外的抗肝癌作用,并初步探讨其损伤肿瘤细胞线粒体,抑制其增殖和诱导死亡的机制。方法:1.以人肝癌细胞株BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B、HepG2、SK-HEP-1和人正常肝细胞株Chang氏肝、HL7702为研究对象,应用MTS法和中空纤维测定法观察YSL在体内外对肝癌细胞和正常肝细胞增殖的影响;建立裸鼠移植瘤模型,观察YSL对BEL-7402肿瘤生长的抑制作用,并以透射电镜观察YSL对裸鼠移植瘤肿瘤细胞超微结构的影响。2.应用流式细胞术观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响;并以流式细胞术、DNA Ladder检测和Nucleosome ELISA的方法观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞的诱导凋亡作用。3.应用基因芯片技术分析YSL对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤肿瘤细胞基因表达谱的影响。4.以流式细胞仪和荧光检测仪观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞线粒体通透性转变孔开放,线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度的影响。5.应用Western Blot方法,观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞线粒体凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达的影响;分离肿瘤细胞的胞浆组分,观察YSL对BEL-7402细胞线粒体释放促凋亡物质细胞色素C和激活半胱天冬酶Caspase-3的影响;观察YSL对肿瘤细胞钙稳态调节蛋白钙网蛋白(Calreticulin)和内质网凋亡通路的Capase-12蛋白表达的影响6.应用实时荧光定量PCR和Western Blot方法观察,观察YSL体外对人肝癌BEL-7402细胞PI3K信号通路调节和效应因子PTEN、Akt、PDK1、P21、P27、PDK1、MDM2、P53和Bad的mRNA和蛋白表达,以及磷酸化修饰的影响。结果:1.YSL在体外(0.4~3.2mg/ml)和体内(320~640μg/kg╱d)均能够明显抑制前述五种人肝癌细胞株的增殖(P<0.05),但对正常人肝细胞株HL7702和Chang氏肝则没有明显影响(P>0.05);组成酪丝亮肽三种氨基酸等摩尔比混合物对肿瘤细胞的增殖没有抑制作用,YSL的抗肿瘤作用机制与其小分子多肽的结构有关;YSL(320μg/kg/d、640μg/kg╱d)能够明显抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生长(P<0.05),肿瘤生长抑制率分别为40.04%和52.85%。超微结构研究发现,YSL可引起肿瘤细胞的染色质溶解,线粒体肿胀,溶解,内质网扩张,细胞出现坏死和凋亡。2.基因芯片分析结果显示YSL可以抑制肿瘤细胞线粒体呼吸链功能相关基因表达,影响钙稳态调节基因以及与肿瘤细胞增殖相关基因的表达,影响肿瘤细胞的信号转导通路基因,还可调节与药物代谢相关基因、癌基因/抑癌基因的表达。3.YSL(0.8,1.6mg/ml)能够在体外阻抑人肝癌BEL-7402细胞的细胞周期,使G0/G1期细胞百分比明显增高,S期百分比明显降低(P<0.05);能够使凋亡细胞数明显增多,增加肿瘤细胞凋亡核小体DNA的产生数量,形成明显的DNA Ladder。4.YSL(0.8,1.6mg╱ml)能够在体外激活BEL-7402细胞线粒体通透性转变孔的开放,降低线粒体膜电位,影响线粒体膜的通透性,增加肿瘤细胞中的钙离子浓度。5.YSL能够在体外抑制BEL-7402细胞中抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL的蛋白表达,诱导线粒体释放促凋亡物质细胞色素C,增加活化Caspase-3的数量;YSL能够增加BEL-7402细胞中内质网钙稳态调节蛋白Calreticulin和内质网凋亡通路的Capase-12的蛋白表达。6.YSL能够上调肿瘤细胞中抑癌基因PTEN的表达和活性,抑制癌基因Akt的表达和活性,以及Akt相关蛋白激酶PDK1的活性。并籍此影响Akt通路的下游事件达到抗肿瘤效应:增加P21、P27的表达阻抑细胞周期,抑制肿瘤增殖;通过使癌基因MDM2蛋白产物失活,稳定抑癌因子P53的数量,促进肿瘤死亡;解除对促凋亡因子Bad的磷酸化抑制,损伤肿瘤细胞线粒体,诱导肿瘤凋亡。结论:YSL能够在体内外明显抑制肝癌细胞的增殖,阻抑肿瘤细胞的细胞周期,诱导凋亡和坏死,而对正常肝细胞无明显影响。其作用机制可能是通过损伤肿瘤细胞线粒体膜,激活MPTP孔开放,降低线粒体膜电位,进而影响线粒体膜通透性,使线粒体中的钙离子,细胞色素C等促凋亡物质释放到胞浆中,激活线粒体凋亡途径和内质网应激凋亡反应,诱导肿瘤细胞凋亡。同时使肿瘤细胞PI3K信号转导途径内抑癌基因表达增加,癌基因表达下降,达到抗肿瘤细胞效应。
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