【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis）是肝硬化的早期阶段,是细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在肝脏中病理性沉积的结果。各种慢性肝损伤,包括肝炎病毒感染,长期酒精过量摄入,化学毒素摄入（黄曲霉素B1）、代谢性或自身免疫反应等,均会引起肝纤维。肝纤维化进一步发展可引起肝硬化,部分患者可导致肝癌,阻断肝纤维化将有效逆转该进程,阻断其进一步发展。但肝纤维的发病机制尚不明确,临床方面缺乏公认有效的防治手段。肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factors,HNFs）家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）等,是一组在肝细胞中优势表达的转录因子,相互作用并构成强大的转录因子网络系统,在促进肝细胞分化和功能维持方面发挥重要作用。HNF3β,即翼状螺旋转录因子FOXA2,主要表达于肝脏、胰腺、肺等。在肝脏发育及维持肝脏功能方面如糖脂代谢、胆汁酸代谢等具有重要作用。前期研究我们利用HNF4α和HNF1α治疗肝纤维化,并藉此提出利用转录因子治疗肝纤维化的新策略。在本研究中我们将探讨HNFs中另一个成员FOXA2对肝纤维化的可能治疗作用及其作用机制。在前期研究中,我们检测了临床肝纤维化病人的肝组织标本以及四氯化碳（Carbon Tetrachloride,CCl₄）肝纤维化模型的小鼠肝组织标本,发现在肝纤维化组织中,FOXA2表达均较对照组下调。分离CCl₄造模小鼠不同时期的小鼠原代肝细胞及肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）,发现在肝纤维化过程中,肝细胞FOXA2表达逐渐下调而HSCs中的FOXA2却逐渐升高。为进一步探究FOXA2在肝纤维化中的作用,我们构建了四种模式小鼠,结果显示:特异性敲除肝细胞中FOXA2基因可促进肝纤维化发生;上调肝脏中FOXA2或特异性上调肝细胞中FOXA2表达均可改善肝纤维化;但特异性上调HSCs中FOXA2对肝纤维化进程并无显著影响。基于前期研究结果,我们推测FOXA2可能通过保护肝细胞来改善肝纤维化,并非通过抑制HSCs活化,但其具体机制尚未明确。本课题在明确了FOXA2可有效治疗肝纤维化的基础上,进一步探讨其抗肝纤维化的作用机制。【实验方法】一、CCl₄诱导肝纤维化动物模型的构建按3:1比例混匀植物油和CCl₄,采用腹腔注射小鼠建立肝纤维化模型,注射剂量为0.25ml/kg,每周2次,连续4至5周。二、于CCl₄造模不同时间点,通过尾静脉注射不同病毒载体调控肝脏FOXA2表达,建立三种不同模式小鼠1.肝细胞特异性敲除FOXA2的小鼠肝纤维化模型:采用LoxP-Cre重组系统,6周龄的FOXA2^loxP/loxP基因小鼠（美国杰克逊实验室,022620）通过尾静脉注射AAV8-TBG-Cre（前期已构建完成）2×10¹¹ Vg/只,特异性敲除小鼠肝细胞FOXA2,2周后采用CCl₄腹腔注射构建肝纤维化小鼠模型;2.肝细胞特异性过表达FOXA2的小鼠肝纤维化模型:通过腺病毒载体pENN-AVV-TBG-PI-RBG（the Penn Vector Core,p1015-R）构建具肝细胞特异性的FOXA2过表达质粒,进一步包装成病毒AAV8-TBG-FOXA2（已完成）。通过尾静脉注射至CCl₄造模一周的慢性肝纤维化小鼠模型中,特异上调肝细胞FOXA2表达。3.肝脏过表达FOXA2的肝纤维化模式小鼠:利用慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP（系统生物学）构建肝脏非特异性慢病毒LV-FOXA2（已完成）,通过尾静脉注射病毒LV-FOXA2于CCl₄造模两周的慢性肝纤维化小鼠模型中,非特异上调肝脏FOXA2表达。三、FOXA2对肝纤维化过程中内质网应激和氧化应激的影响分离小鼠原代肝细胞,通过Real-time RT-PCR分别检测单纯特异性敲除肝细胞FOXA2和特异性敲除肝细胞FOXA2后进行CCl₄造模对肝脏特异性基因的影响。利用上述三种调控FOXA2的小鼠肝纤维化模型:肝细胞特异性敲除FOXA2、肝细胞特异性过表达FOXA2以及肝脏非特异性过表达FOXA2模式小鼠。采用Western blot和免疫组化分析各组小鼠肝脏中CHOP等内质网应激变化情况;利用丙二醇（malondialdehyde,MDA）试剂盒检测各组小鼠肝脏中MDA变化情况,通过Western blot检测小鼠肝脏中Nitrotyrosine蛋白变化以明确氧化应激的变化情况。四、FOXA2对肝纤维化过程中细胞凋亡的影响使用TUNEL试剂盒检测肝细胞特异敲除FOXA2模式小鼠肝脏标本中的细胞凋亡情况;利用Western blot及免疫组化检测不同模式小鼠肝组织标本中凋亡相关基因（Bax、Cleaved caspase 3）的变化情况。五、统计学分析数据采用软件SPSS 18进行统计学分析。分析结果以均数±标准差表示,各组间统计分析采用方差分析（ANOVA）及t检验等,以P<0.05视为检验标准。【实验结果】一、FOXA2可减轻肝纤维化进程中的内质网应激1.特异性敲除肝细胞FOXA2可加重内质网应激,促进肝纤维化Real-time RT-PCR结果显示:未造模的条件下,小鼠成年后单纯特异性敲除肝细胞FOXA2表达未能影响肝细胞中肝特异基因（糖脂代谢和肝酶合成相关）的表达;而小鼠经腹腔注射CCl₄进行纤维化造模,肝特异性基因发生轻微变化;更重要的是,与对照造模组相比,FOXA2^H-KO+CCl₄组小鼠原代细胞中肝特异性基因的转录表达显著下降;说明在纤维化病理条件下,肝细胞中肝特异功能基因的正常转录需要FOXA2。Western blot结果表明:单纯特异性敲除肝细胞FOXA2未能诱发内质网应激,CCl₄造模可导致内质网应激水平升高;在小鼠CCl₄肝纤维化模型中,较对照造模组而言,FOXA2^H-KO+CCl₄组小鼠肝脏中CHOP表达显著升高,提示特异性敲除肝细胞FOXA2可进一步加重纤维化肝脏中的内质网应激。免疫组化显示:各组小鼠肝组织中的CHOP变化趋势和Western blot结果一致。2.特异性上调肝细胞FOXA2表达可抑制内质网应激,改善肝纤维化Western blot结果显示:FOXA2组较对照组而言,肝组织中的CHOP蛋白水平明显下降。3.过表达肝脏FOXA2可抑制内质网应激,减轻肝纤维化Western blot结果提示:CCl₄造模可显著诱发小鼠肝脏内的CHOP表达水平升高,过表达肝脏FOXA2后可抑制该蛋白水平的升高。综上,这些结果表明,内质网应激参与FOXA2调控肝纤维进程。二、FOXA2可减轻肝纤维进程中的氧化应激1.特异性敲除肝细胞FOXA2可促进氧化应激,加重肝纤维化MDA比色法及Western blot结果显示:CCl₄可轻度升高纤维化肝脏中的氧化应激水平;在小鼠CCl₄模型中,与对照造模组相比,特异性敲除肝细胞FOXA2表达后MDA水平及Nitrotyrosine水平显著升高,说明肝细胞特异性敲除FOXA2可进一步加重纤维化肝脏中的氧化应激水平。2.特异性过表达肝细胞FOXA2可抑制氧化应激,改善肝纤维化Western blot结果显示:FOXA2组较对照组而言,肝组织中Nitrotyrosine蛋白水平明显减少。3.过表达肝脏FOXA2可抑制氧化应激,减轻肝纤维化Western blot结果提示:CCl₄造模可显著诱发小鼠肝脏内Nitrotyrosine表达水平升高,过表达肝脏FOXA2后可抑制Nitrotyrosine蛋白的升高。综上,这些结果表明,氧化应激参与FOXA2调控肝纤维进程。三、FOXA2调控肝纤维进程,与肝细胞凋亡相关1.肝细胞特异性敲除FOXA2通过加重肝细胞凋亡促进肝纤维化TUNEL结果显示:单纯特异性敲除肝细胞FOXA2的未造模小鼠与野生型未造模小鼠相比,其肝组织中未见自发细胞凋亡;CCl₄可诱发轻度细胞凋亡;更重要的是,FOXA2^H-KO+CCl₄组小鼠肝脏中细胞凋亡程度较对照造模组而言明显加重;Western blot检测提示:FOXA2^H-KO+CCl₄组小鼠较对照组而言,Bax及Cleaved caspase 3蛋白水平显著升高,定量具统计学意义;免疫组织化学法显示:与Western blot中Cleaved caspase 3的变化趋势一致,且该蛋白主要定植于肝细胞的细胞质中;说明肝细胞特异性敲除FOXA2可加重纤维化肝脏中的肝细胞凋亡,促进肝纤维化。2.特异性上调肝细胞FOXA2表达可抑制细胞凋亡,减轻肝纤维化Western blot结果显示:较对照组而言,FOXA2组肝组织中凋亡相关基因Bax及Cleaved caspase 3表达水平均下降。免疫组织染色法趋势与Western印迹法结果一致,Cleaved caspase 3染色主要位于肝细胞胞浆中。3.上调肝脏FOXA2表达可抑制细胞凋亡,改善肝纤维化Western blot结果提示:CCl₄造模可上调小鼠肝脏内凋亡相关基因的表达,而特异性上调肝细胞中的FOXA2表达后能够抑制这些基因蛋白的升高。综上提示,FOXA2通过调控肝细胞凋亡影响肝纤维进程。【结论】一、CCl₄诱导小鼠慢性肝纤维化损伤可诱导小鼠体内内质网应激及氧化应激,其可介导肝细胞凋亡。二、FOXA2可减轻肝纤维化过程中的内质网应激。三、FOXA2可抑制肝纤维化过程中的氧化应激。四、FOXA2可缓解肝纤维化过程中肝细胞的凋亡。五、上调肝细胞FOXA2表达可能通过抑制ROS或CHOP诱导的肝细胞凋亡,而缓解肝纤维化,FOXA2和保护肝细胞可能为治疗肝纤维提供新的思路和方向。