茉莉酸及其衍生物（统称为茉莉素）是一类新的植物生长调节剂。茉莉素广泛存在于高等植物中，其生物合成由亚麻酸经脂肪氧合酶途径合成，它对植物的生长发育如根的生长、果实成熟、块茎增大以及花粉形成等有重要影响，它作为伤反应所必须的信号分子来调控植物对逆境、伤害，病原物侵染以及害虫侵袭的反应。 尽管茉莉素对植物的影响已有广泛的研究，但对其作用分子机理研究极少。COI1基因是从拟南芥中分离的茉莉素信号传递途径中的唯一基因，它介导茉莉素所调控的植物育性及抗性。coil突变体对茉莉素不敏感，表现雄性不育，抗性完全丧失。根据由COI1序列所得到的蛋白质氨基酸序列分析表明COI1含有2个重要的功能域，即16个富含亮氨酸重复序列和一个F-box。人和酵母等许多生物中都含有F-box蛋白，它与SKP1和cdc53（cullin）形成泛素连接酶复合体，称为SCF复合体，其作用是选择性结合降解蛋白参与泛素蛋白降解途径，而泛素蛋白降解系统可以调控许多重要过程如细胞循环，信号传导，基因转录以及免疫反应，雄性不育和细胞程序化死亡。对生物的生长发育及生物和非生物逆境的反应有重要作用。由于COI1含有F-box功能域，因此，COI1也很可能是SCF组成成分，介导茉莉酸信号传导途径。本研究以COI1为诱饵采用酵母双杂交分析体系筛选拟南芥cDNA文库，分离和鉴定COI1互作基因，得到COI1互作基因12个，其中ASK1与SKP1基因高度同源，并从遗传学、分子生物学等方面，首次证明ASK1和COI1形成复合体，并一起调控植物育性，进一步分离得到ASK1互作基因24个，完成了序列分析，为阐明茉莉素调控植物生长发育的分子机理提供了重要线索，并为作物抗性和雄性不育基因工程提供了新思路。 主要研究结果如下： 1、酵母双杂交试验 获得ASK1、COAP2、COAP3、COAP4等12个重要COI1互作基因。 首次以COil为诱饵利用酵母双杂交分析体系筛选拟南芥cDNA文库，得到 300多个阳性克隆，经PCR、Rsalk切PCR产物以后归为12群，从代表菌落提 取吓42＊D C＊＊A重组质粒进行了测序，完成了序列分析，得到＊SK！、＊0＊＊2、 COAP3、COAP4等12个基因，其中ASKI、COAPZ、COAP3等基因与SKPI等 重要基因有较高的同源性。证明了COil与ASKI、COAPZ和COAP3能强烈互作。 2、COnk作基因功能分析 （！）T—DNA筛选 筛选T CDS—7和CD6—7 2个T—DNA株系DNA库，但未得到供试基因 ASKI、COAPZ、COAP3和COAP4的阳性结果。 （）首次利用反义RNA技术，从邀传上、分于生物学、生物化学等方面证明 了ASK！词控植物曹性 构建了ASKI、COAPZ、COAP3和COAP4等反义玉因，完成了拟甫芥的转 化，获得36株转反义ASKI植株，其中27株表现雄性不育，6株育性降低，获 得转反义COAPZ，转反义COAP3、转反义COAP4植株，分别为57株、96株和 ！02株，都表现可育。证明了所有转反义基因植株在对McJA的反应以及抗虫性、 杭病、抗干早等方面与野生型植株没有差异。以野生型植株花沏和转反义ASKI 基因雄性不育植株杂交，FI代和BCI代可育与不育株比例坏为1：！。完成了转反 义 ASKI基因雄性不育植株的 PCR、RT—PCR、Western blot等分子检测，结果表 明转ASKI反义基因雄性不育植株中ASKI的表达受到显著抑制。从而证明ASKI 橱控植物育性。 3、完成了GST—ASKI融合蛋白的表达与纯化。建立了ASKI在酵母中的表 达及纯化体系。获得GST—ASKI t合蛋白纯化产物10mg左右。 4、建立了COil在大肠杆茵中的表达及纯化体系。完成了COil蛋白的表达 及纯化，获得COil蛋白纯化产物！sing左右。 5、分别建立了ASKI、COil抗血清制备体系，获得了效价高、专一性强的 。一ASKI、a—COil抗血清。 6、完成了a—ASKI、a—COil 抗血清的专一性检测。采用ELISA 以及 ＿． Western blot分析体系证明 a—ASKI、a—COil具有很强的专化性，只和其相应 二 的蛋白专一结合． 7、创建了COil和ASKI的共免疫沉淀试验体系，国际上首次证明ASKI和 COil在植物体内形成蛋白复合体，并一起记控植物育性。 8、获得ASKI互作基因24个。 以ASKI为诱饵，继续筛选了拟南芥酵母双杂交。DNA文库，获得24个ASKI 互作基因。序列分析表明，其中有很多重要基因，PLYI57和PLYB49含F—b。X， PLYI57可能与硫吸收代谢有关。 9、首次提出拟南芥中茉莉酸信号传递途径与拟南芥中SCF复合体及作用等 模型。