肺癌是全球发病率最高的肿瘤,死亡率居男性肿瘤的首位,在我国的发病率呈现逐年递增的趋势。其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占85%,临床症状出现时,多已发展到中晚期,传统的治疗方法效果并不理想,延长生存期有限,且治疗费用很高。肺癌早发现早治疗能明显提高患者的生存率和生活质量,资料显示,I期肺癌患者10年存活率达88%,III/IV期肺癌患者5年存活率仅为15%左右。然而,早期肺癌常表现为无症状的肺微小结节,即使X光胸片体检也很难准确诊断,只有病灶大时胸片才能发现。低剂量CT能使早期肺癌检出率明显提高,但不适合常规体检,并且目前还没有诊断特异的肺癌分子生物标志物,因此大部分的肺癌患者在就诊时已到晚期。可见,对NSCLC人群的早期筛查显得非常必要。通过对肺癌基因及其作用机制的研究,实施精准分子靶向治疗成为当前的重要研究方向。因此,通过在分子水平上探索NSCLC的发生发展机制,寻找特异性强、敏感性更高的分子作为诊断标志物或潜在的治疗靶点,将为NSCLC的早期诊断和治疗提供新策略,具有一定的公共卫生意义。miRNA是一类进化保守的短链RNA分子,长约22 nt,它们的主要作用方式是通过与靶位点mRNA的3’非编码区(3’-UTR)结合,诱导mRNA降解或抑制mRNA的翻译过程,从而造成靶基因的蛋白质水平下降。miRNA参与了癌症患者体内的多种生物学行为,包括细胞增殖、分化、侵袭、转移和疾病预后等,在不同类型的恶性肿瘤演变中miRNA均扮演了重要角色。单个miRNA可以同时靶向多个基因的mRNA,同时单个mRNA也可以同时被多种miRNA调节。由于细胞内大量的miRNA的存在,这种双向的调节方式构成了细胞内复杂的作用网络,参与了生物体内许多生理过程和疾病的发生。miRNA表达存在细胞或组织特异性,而疾病(包括肿瘤)的发生发展也表现为某些miRNA表达失调。近些年来,通过研究NSCLC组织中miRNA表达谱的分布,发现NSCLC中存在众多表达失调的miRNA。研究证明这些特异性的miRNA与NSCLC的发生、转移、侵袭、增殖和预后密切相关,可能成为恶性肿瘤诊断与治疗的潜在生物标志物。miRNA在NSCLC中作用机制的研究已经取得了较大进展,研究表明,众多miRNA对NSCLC的发生发展具有重要的促进或抑制作用。我们的研究以NSCLC组织中特异性表达降低的miR-326为出发点,对其在NSCLC细胞中的生物学功能进行研究,从体内外到体内探讨其对NSCLC的发生发展的影响,以期为NSCLC的早期诊断和治疗提供新的研究依据。第一章肺癌组织以及NSCLC细胞系中miR-326表达水平的变化目的:为了验证肺癌组织miRNA高通量测序数据中miR-326的表达差异,利用RT-PCR检测miR-326在人类非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)患者癌组织以及癌旁组织中的表达差异情况,并在正常人胚肺成纤维细胞系 HELF 和人类 NSCLC 细胞系 A549、SPC-A-1、H1299、SK-MES-1 和 95-D 中验证miR-326表达情况。方法:miR-326是从本课题组miRNA高通量测序数据中筛选出的具有显著表达差异的miRNA,高通量测序显示其在肺癌组织中低表达。利用qRT-PCR技术,我们对来自武汉大学中南医院肿瘤科39对肺癌和癌旁组织样本中miR-326的表达进行测定。并且对人胚肺成纤维细胞系HELF和人类NSCLC细胞系A549、SPC-A-1、H1299、SK-MES-1 和 95-D 中 miR-326 表达进行了验证。结果:通过对肺癌及癌旁组织中miR-326的表达进行比较分析,结果显示,肺癌组织中miR-326的表达与癌旁组织存在明显差异,且差异具有统计学意义(p<0.05)。肺癌中miR-326的表达明显低于癌旁组织。同时,体外细胞实验结果显示,miR-326在正常肺细胞系中的表达明显高于其在肺癌细胞中的表达,与组织中的表达趋势一致,且与高通量测序结果一致。结论:miR-326在NSCLC组织中和肺癌细胞系中均呈现低表达。第二章miR-326对NSCLC细胞生物学行为及裸鼠体内成瘤能力的影响目的:明确miR-326在人NSCLC细胞中的生物学功能及对裸鼠体内NSCLC细胞成瘤的影响。方法:利用合成的miR-326模拟物和抑制剂及其阴性对照,瞬时转染人NSCLC细胞株A549和SPC-A-1,探讨miR-326在NSCLC细胞中的潜在生物学功能。采用CCK-8、BrdU和平板克隆三种方法,检测miR-326对NSCLC细胞增殖能力的影响;利用流式细胞术检测miR-326对NSCLC细胞凋亡的影响;利用划痕和Transwell实验观察NSCLC细胞迁移和侵袭能力的变化。通过裸鼠成瘤实验检测miR-326在体内环境下对NSCLC细胞成瘤能力的影响。结果:在细胞功能实验中,CCK-8检测表明在24、48、72和96 h时,miR-326 过表达组的 OD 值与对照组相比明显降低,干扰 miR-326 组的 OD 值则明显升高;BrdU结果显示,miR-326过表达能显著降低染红细胞所占比例,减少NSCLC细胞的DNA合成,即抑制细胞的增殖。而miR-326抑制可提高染红细胞所占比例,提示DNA的合成增多,细胞的增殖能力增强;流式细胞仪检测的凋亡结果显示,miR-326过表达可明显增加肺癌细胞中处于早期凋亡的细胞比例,而干扰miR-326可明显减少此比例;划痕实验结果显示,miR-326过表达可显著抑制NSCLC细胞A549和SPC-A-1的迁移能力,而抑制miR-326表达可显著增强两种NSCLC细胞的迁移能力;Transwell迁移和侵袭实验结果显示,抑制miR-326表达可显著增强细胞的迁移和侵袭能力,而miR-326过表达可显著降低NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验显示,miR-326过表达能明显减少体内肿瘤组织的体积,降低其重量,表明miR-326能抑制裸鼠皮下A549细胞的成瘤能力,因此,miR-326在体内环境中也能显著抑制肺癌细胞增殖。结论:miR-326能够显著抑制NSCLC细胞A549和SPC-A-1的增殖、侵袭和迁移能力并诱导细胞凋亡,并且其对体内NSCLC增殖也具有显著的抑制作用。因此miR-326是一种抑制癌症发生和发展的miRNA。第三章miR-326通过靶向调控NSCLC中CCND1的表达发挥抑癌功能目的:探讨miR-326在肺癌细胞中对CCND1的靶向调控作用机制及其对肺癌细胞增殖和转移的影响。方法:利用生物信息学预测并验证miR-326的靶标CCND1,通过荧光素酶报告基因验证miR-326与CCND1结合的可能性。利用合成的miR-326模拟物和抑制剂改变肺癌细胞系中miR-326和CCND1的水平,运用qPCR和Western blot来验证miR-326通过抑制CCND1表达来发挥抑癌作用。另外,我们运用侵袭实验、迁移实验、克隆形成实验检测了 CCND1对肺癌细胞增殖和转移的影响。之后我们检测了 miR-326对肿瘤生物学行为相关蛋白casepase-3、casepase-7、cyclin D2、p21、p57、MMP7、MMP9 以及 cleaved casepase-3 表达的影响。结果:miR-326能够靶向结合CCND1的3’-UTR区域,miR-326过表达能够显著抑制细胞中CCND1表达,从而使CyclinDl蛋白表达水平降低。另外,miR-326 能够影响肺癌细胞中 casepase-3、casepase-7、cyclinD2、p21、p57、MMP7、MMP9 以及 cleaved casepase-3 等的表达。结论:miR-326可通过调控CCND1信号通路来影响肺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移。