背景与目的肾移植是治疗终末期肾病患者的最有效手段,近年来随着对移植免疫的进一步认识以及新型免疫抑制剂的问世,急性排斥反应明显下降,但是移植肾的长期存活率并没有显著改善,慢性排斥反应已成为阻碍移植肾长期存活的主要原因。迄今为止,对慢性排斥反应的防治主要集中于几种免疫抑制剂,这些药物都是非特异性的免疫抑制剂,治疗效果不明显,并且具有严重的副作用,尚无任何药物及其他疗法能真正有效地防治移植肾慢性排斥,临床上迫切需要寻求防治移植肾慢性排斥的新途径。骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓中的非造血细胞集落,在不同的诱导条件下,可以分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、脂肪细胞等。既往研究表明,MSCs具有低免疫原性,能够逃避免疫排斥,并且具有免疫抑制特性以及组织修复/再生作用,不少学者推测输注MSCs有望诱导移植物包括移植肾的免疫耐受,达到移植物的长期存活。然而,尽管大量的体外试验数据提示MSCs可能能够抑制移植排斥反应,但是相关的体内试验研究仍然比较缺乏,且结论不一。在某些研究中MSCs可促进受者对移植物的耐受,而某些研究则没有影响甚至可引起或加重排斥。目前比较肯定的是MSCs在狒狒体内可延长皮肤移植物的存活期；可治疗骨髓移植后的移植物抗宿主病,已经进入了Ⅰ期和Ⅱ期临床试验,并且显示了良好的临床效果。在心脏移植方面,则有不同研究结论,有的研究发现可减轻排斥,有的发现甚至会加重排斥。导致这种不同研究结果的原因可能是MSCs在不同试验条件下处于不同的免疫微环境以及输注MSCs的时间以及用量等的不同。MSCs还可以减轻胰岛细胞移植的排斥反应。目前多数研究认为MSCs需在一定条件下尤其是同时联合使用短期的免疫抑制剂才有望诱导长期的移植物耐受。目前有关间充质干细胞对肾移植的效应的研究较少,部分研究发现骨髓间充质干细胞能够减轻大鼠肾移植急性排斥反应,减少移植肾组织炎症介质如IL-1、TGF-β1等的表达,对大鼠早期移植肾具有保护作用。还有研究发现人肾移植供者来源的脂肪MSCs在体外能显著抑制受体-供者的混合淋巴细胞反应,显著抑制肾移植受者移植前和移植后T细胞的增殖。但至今未见MSCs对于移植肾慢性排斥的远期效果的影响的体内研究,更未见其对肾移植慢性排斥的体内免疫调节作用机制的研究。国际上公认的大鼠肾移植慢性排斥模型就是在短期使用小剂量的免疫抑制剂环孢素条件下形成的,该模型于移植后8-12周可出现典型的慢性排斥表现,采用这个模型用于研究MSCs的作用符合加用免疫抑制剂的条件。因此,本研究采用这类模型作为研究对象,采用文献报道的具有体内体外免疫抑制作用的细胞数量,同时根据文献报道的MSCs的一般传代规律,制定了干预时间点,观察MSCs在同时短期使用环孢素A的条件下,对大鼠肾移植慢性排斥模型移植肾组织病理学和TGF-β1表达的影响及其不良反应和副作用,判断其确切治疗效果；并通过检测血清和肾组织Th1/Th2相关细胞因子的分泌水平,观察其在大鼠肾移植慢性排斥模型的体内免疫调节作用,探讨其可能的体内免疫调节机制,为临床应用MSCs防治肾移植慢性排斥、诱导移植肾长期存活提供进一步的体内实验数据。方法1、SD-Wistar大鼠肾移植慢性排斥模型的建立和改进分别选用SD大鼠和Wistar大鼠作为供体和受体,采用显微外科手术技术行SD-Wistar左肾原位肾移植术。麻醉后分离供体左肾动脉、静脉、部分腹主动脉及输尿管,切取供肾前用4℃乳酸林格氏液(含肝素25U/ml)通过腹主动脉原位灌注供肾至呈均匀土黄色。供肾置于4℃乳酸林格氏液无菌保存。在离断受体左肾动脉、静脉及输尿管后切除左肾,供、受体左肾动脉、肾静脉及输尿管分别行端端吻合。受体右肾不切除,完整保留作为每个移植肾样本的内对照。成活受体于手术当天及手术后9天,腹腔注射环孢素A微乳化剂2mg/kg,每日1次,以抑制急性排斥反应。手术后当天一次性肌注氨苄青霉素钠50mg/kg预防感染。术后4周、8周、第12周各取2只成活受体,处死后迅速摘取移植肾,用10%中性福尔马林固定,制作石蜡切片,行HE、PAS和PASM-Masson’s染色,光镜下动态观测组织病理学变化情况,按照Banff 2007移植肾病理分类方案,判断是否出现慢性排斥。随机选取8只接受CsA短期治疗的受体,于术后第4天从尾静脉采血测定CsA浓度谷值。2、大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定采用全骨髓贴壁分离培养法培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞。取4周龄雄性SD大鼠处死,无菌条件下取其长骨,反复冲洗骨髓腔,收集细胞悬液。1000r/min,离心5min后,弃去上清。用含20%胎牛血清的L-DMEM培养基重悬细胞,接种于培养瓶中,置于37℃、50mL/LCO2培养箱培养。传代培养至第三代,倒置显微镜下观察MSCs形态；分别取P3代生长状态良好的细胞,采用流式细胞术检测其细胞周期：取生长良好的第三代细胞,应用流式细胞术检测其CD29,CD34,D44,CD45阳性率,同时用小鼠IgG1-FITC和IgG1-PE作为同型抗体对照；同时做骨髓间充质干细胞成脂肪细胞诱导分化以进一步鉴定MSCs。取P3代生长状态良好的细胞,用诱导脂肪样细胞的诱导培养液培养,2周后行油红O染色观察有否出现脂肪滴。3、供者骨髓间充质干细胞对大鼠肾移植慢性排斥移植肾组织病理学的影响SD雄性大鼠作为供者,Wistar雌性大鼠作为受体,行SD-Wistar大鼠左肾原位移植。保留受体自身右肾作为每一个移植肾的内对照。所有受体均于术后当天一次性肌肉注射氨苄青霉素50mg/kg体重预防感染。取肾移植手术成功存活受体23只进入实验分组。23只成功移植的受体分成MSCs+环孢素A治疗组(简称治疗组,n=8)、环孢素A对照组(简称对照组,n=8)及单纯移植组(n=7)。治疗组和对照组所有受体均从术后当天起给予10天的小剂量环孢素A(2mg/kg.d,腹腔注射)治疗,以抑制急性排斥反应。治疗组(n=8)每只受体除给予小剂量环孢素A治疗外,另取SD大鼠来源骨髓MSCs,制备成1×107个/ml细胞悬液,于手术当天关腹前从左髂静脉注入1×107个/kg体重MSCs,于术后第3天和第7天从尾静脉再次注入同样剂量的MSCs。MSCs输注后每日观察治疗组受者可能出现的不良反应。对照组(n=7)则注入相同容量的生理盐水。单纯移植组未接受MSCs以及环孢素A免疫抑制治疗。移植后第4周即陆续获取单纯移植组双肾行大体观察及组织病理学检测。移植后12周,治疗组和对照组受体大鼠处死后,迅速摘取移植肾和受体自身右肾,分别行HE染色、PAS染色和PSM-Masson染色。参照Banff1997以及Banff2007移植肾病理分类方案制定评分标准,由两位观察者光镜下双盲方式观测对比组织病理学变化情况,分别对移植肾组织的肾间质炎(i,单个核细胞波润)、间质纤维化(ci)、肾小管萎缩(ct)、移植肾肾小球病(cg)、动脉内膜纤维性增厚(cv)等慢性损害进行评分,每项分为0-3分,总分0-15分。另外计算每张切片硬化的肾小球占所有肾小球的百分比。同时对治疗组和对照组所有受者作大体解剖以了解MSCs有无诱发肿瘤。4、免疫组织化学染色检测转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达留取治疗组和对照组术后12周移植肾和受体自身右肾部分肾组织作免疫组织化学染色检测TGF-β1的表达。5、酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清和移植肾组织细胞因子浓度水平移植后12周,采集治疗组和对照组受体以及8只健康Wistar大鼠血清和肾组织行ELISA检测IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10浓度。结果1、整个实验过程共65对大鼠施行肾移植手术,预实验阶段37对和正式实验28对,预实验阶段存活受体20只,其中移植肾存活12只,成功率只有32%；正式实验成活受体24只,其中移植肾存活23只,成功率82%。正式实验阶段热缺血时间10S-15S,冷缺血时间40min-60min,总手术时间2h-2.5h,其中受体肾移植手术时间1.5-2h。术后第12周,移植肾仍存活,体积较右肾缩小,色泽较苍白,光镜下呈典型的慢性排斥病理改变,尤以小动脉内膜纤维样增厚为其特征性组织学改变。阴性内对照的右肾未出现任何组织学改变。术后第4天环孢素A浓度谷值是153.2±17.1ng/ml。2、MSCs原代细胞传代培养至第三代,光镜下见细胞呈梭形、星形,成纤维样,细胞形态较均一。使用流式细胞仪对P3代MSCs进行细胞周期检测,结果显示MSCs中G0/G1期的细胞约占81.5%以上。利用FCM检测培养的P3代骨髓间充质干细胞表面标记物,实验结果发现,CD29阳性细胞的比例达到98.3%；CD44阳性细胞达到99.2%；CD34和CD45阴性细胞的比例分别为98.9%、96.6%。P3代骨髓MSCs经成脂诱导2周后见大量脂肪滴相互融合,细胞由长梭形变为圆形或多边形,油红0染色显示有大量红色脂滴沉淀,证实为脂肪细胞。3、单纯移植组在4周内所有受体移植肾明显肿胀增大,暗淡,移植肾坏死。治疗组输注MSCs后无1例次出现寒战、呼吸困难等不良反应,无发现术口感染以及其他感染情况。术后12周,两组各组织器官均未见肿瘤发生；治疗组和对照组两组大鼠纳入统计的受体移植肾均存活,体积较正常右肾略小,色泽较苍白,出现不同程度的慢性排斥组织病理学改变。治疗组大鼠移植肾组织的各种组织病理学损害(5.13±0.99)均较对照组(10.13±0.99)减轻(P=0.000),肾小球硬化率(%,12.44±1.01)低于对照组(%,27.21±3.23)(P=0.000)4、治疗组和对照组移植肾肾小管上皮细胞、间质细胞及肾小球的TGF-β1表达均可呈阳性,并且染色强度较强。治疗组移植肾组织的TGF-β1表达低于对照组(P=0.043)。5、治疗组血清IL-4浓度(pg/mL,48.18±5.43)较对照组(36.67±9.93)高(P=0.008),两组血清IL-10、IFN-γ浓度差异无显著性意义(P=0.105,P=0.455),治疗组血清TNF-α水平(pg/mL)(15.53±9.63)低于对照组(48.81±19.17)(P=0.000)。治疗组血清Th1/Th2(IFN-γ/IL-4) (1.52±0.63)低于对照组(2.47±0.99)(t=2.269,P=0.040)。治疗组和对照组移植肾组织上清液IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α浓度均高于正常组(均有P=0.000)。治疗组移植肾IL-4浓度(311.54±53.45)高于对照组(210.82±56.01)(P=0.000),IL-10、IFN-y以及TNF-α浓度与对照组相比差异无显著性意义(P=0.254,P=0.349,P=0.480),Th1/Th2(IFN-γ/IL-4) (1.41±0.42)(?)低于对照组(2.40±0.83)(P=0.009)。结论1、给予保留受体自身右肾的SD->Wistar大鼠肾移植受体腹腔注射10天小剂量的环孢素A微乳化制剂(2mg/kg.d),可诱导移植肾长期存活并于12周内可形成慢性排斥的典型组织病理学改变,可作为研究肾移植慢性排斥的动物模型；2、采用全骨髓贴壁分离培养法可获取纯度较高的骨髓MSCs。本实验培养的细胞经形态学、细胞表型特点及其可诱导成脂肪细胞分化鉴定证实为骨髓间充质干细胞。3、供者骨髓MSCs可明显改善大鼠移植肾慢性排斥组织病理学损害,对大鼠移植肾具有远期的保护作用。本研究所采用的细胞剂量及用法还不足以诱导移植物完全免疫耐受；该剂量的MSCs输注未发现致肿瘤及感染等副作用,安全性好。4、供者骨髓间充质干细胞在移植肾慢性排斥受体体内能下调移植肾组织TGF-β1的表达；移植肾组织TGF-β1表达的下调可能是MSCs通过其他免疫抑制途径以及其他机制对慢性排斥移植肾产生保护作用后的结果而非原因。5、大鼠慢性排斥移植肾组织可同时高表达Thl类和Th2类细胞因子。供者骨髓MSCs可使Thl/Th2细胞因子在一个高表达水平情况下向Th2方向偏移,可能是其减轻移植肾慢性排斥组织学损害,诱导移植肾免疫耐受的机制之一。