银屑病是一种慢性炎症性皮肤疾病,由免疫系统、炎症介质、银屑病相关易感基因和多种环境因素相互作用所介导的自身免疫性疾病。树突状细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞被异常激活,释放大量炎性细胞因子,刺激角质形成细胞异常增殖,引起银屑病样皮损。研究表明,银屑病也是一种心身疾病,抑郁症是其最常见的伴发疾病之一,抑郁症不仅加重银屑病皮损,而且影响患者生活质量,导致疾病迁延不愈,进而加重患者抑郁情绪,形成恶性循环。抑郁等不良情绪引发机体神经递质分泌紊乱并提高血管通透性促进炎性细胞因子释放,神经递质通过神经免疫系统作用,异常激活免疫细胞,促使炎性细胞因子分泌增多,引发或放大银屑病的炎症反应,被放大的炎症反应又可加重中枢神经炎症,形成恶性循环。而口服抗抑郁药物或心理疏导在一定程度上可以提高银屑病治疗效果,并成为一种重要的干预手段。中医认为抑郁症属于情志病范畴,众多医家提出“从肝论治”银屑病,并取得良好的临床疗效。我的导师李萍教授在银屑病“从血论治”的基础上,结合“从肝论治”银屑病的思路,认为银屑病的发病与肝尤为密切,气机郁滞为银屑病的始发环节,重视肝主疏泄、调畅气机的治疗作用。针对肝郁脾虚型银屑病患者,临床表现为因情绪波动后发病,皮损干燥脱屑呈淡红色,并对称分布,伴有抑郁寡欢、沉闷欲哭,善太息,食欲不佳和失眠等症状,拟用逍遥散加减进行治疗,针对患者不同临床表现,随症加减,疗效颇佳,但其核心方剂-逍遥散的治疗作用尚不明确。为了进一步探究逍遥散干预银屑病的治疗作用及机制,本课题观察咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型是否存在抑郁症表现,此种动物模型是否存在肝郁脾虚证候,并运用逍遥散进行干预,观察其对银屑病小鼠PASI评分、皮损组织形态学、炎性细胞因子和神经递质的含量的影响,从神经免疫调节角度阐明逍遥散治疗银屑病的作用机制。理论研究李萍教授运用逍遥散加减治疗银屑病经验逍遥散出自宋代《太平惠民和剂局方》,主治肝郁血虚脾弱证。经过后世医家传承发展后,在临床中广泛用于内科、妇科和皮肤科等多种疾病的治疗,该文通过介绍银屑病病因病机、逍遥散运用原理及组成方药分析、银屑病与情志的关系、逍遥散对情志的调控研究以及典型案例,总结了李萍授在临床上运用逍遥散随证化裁治疗肝郁脾虚型银屑病的思想和经验,李萍教授结合“精-气-血-津液”辨证,分析肝的生理功能与银屑病的联系,注重气机郁滞为银屑病的始发环节,肝主疏泄、调畅气机对银屑病的治疗作用,以及情志因素的致病作用,分析其热邪的源头,为银屑病的治疗提供新的思路。实验研究实验一 观察咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的抑郁行为学表现目的:观察咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型是否存在抑郁行为,此种动物模型是否存在肝郁脾虚证候。方法:45只BALB/c雄性小鼠,背部备皮后,随机分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、甲氨蝶呤组(Methotrexate,MTX)、氟西汀组(Fluoxetine),氟西汀合用甲氨蝶呤组(Fluoxetine-MTX),每日用5%咪喹莫特乳膏(Imiquimod,IMQ)涂抹小鼠背部诱导银屑病样皮损,连续涂抹8天。采用银屑病皮损面积和疾病严重程度指数(Psoriasis area and severity index,PASI)每日进行评分,光镜下观察皮损组织形态学变化及表皮厚度,免疫荧光法和免疫组化法观察皮损中Ki67及CD3+T淋巴细胞的表达,高通量液相蛋白芯片检测皮损中炎性细胞因子的分泌;观察小鼠体质量变化,糖水偏好实验和旷场实验评价各组小鼠抑郁行为学差异,液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)检测小鼠前额皮质、海马和下丘脑区脑组织5-羟吲哚乙酸(5-Hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、肾上腺素(Adrenaline,Ad)、多巴胺(Dopamine,DA)、谷氨酸(Glutamate,Glu)和高香草醛(Herpes virus ateles,HVA)等神经递质的含量。结果:与空白对照组相比,模型组小鼠皮损鳞屑肥厚、浸润严重、红斑明显,表皮厚度、Ki67及CD3+T淋巴细胞的表达、IL-12p70、IL-17A和IL-23等炎性细胞因子的含量均增加(P<0.05),IL-10含量减少(P<0.01);各治疗组与模型组相比,IL-10含量增加,其余指标表达水平均降低(P<0.05);空白对照组小鼠体质量变化幅度小于模型组(P<0.01);与空白对照组相比,模型组小鼠糖水偏好率显著降低(P<0.01),中央区路程和中央区时间均显著减少(P<0.01),不同脑区中5-HT、Ad、3,4-二羟基苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylaceticacid,DOPAC)、去甲肾上腺素(Noradrenaline,NE)和 γ-氨基丁酸(γ-aminobutylic acid,GABA)含量显著降低(P<0.05);而各治疗组与模型组相比,以上指标均有一定改善。此外,IMQ诱导的银屑病样小鼠毛发凌乱、色泽枯黄,精神萎靡,体质量下降明显,存在肝郁脾虚证的宏观表征。糖水偏好实验及旷场行为学实验表明银屑病样小鼠存在抑郁行为。不同脑区神经递质含量降低,客观指标与肝郁脾虚证一致。结论:咪喹莫特涂抹8天,可导致小鼠出现银屑病样皮损并存在抑郁症表现,此种模型可能存在肝郁脾虚证候。实验二 逍遥散对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠的干预作用目的:观察逍遥散对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损及抑郁行为学的干预作用。方法:36只BALB/c雄性小鼠,背部备皮后,随机分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、甲氨蝶呤组(MTX)和逍遥散高、中、低剂量组(XH、XM、XL),每组6只,5%咪喹莫特乳膏背部涂抹诱导小鼠银屑病样皮损。每日进行PASI评分,光镜下观察皮损组织形态学变化及表皮厚度;免疫组化法检测皮损中T淋巴细胞表面标志CD3表达情况;免疫荧光法检测皮损中Ki67表达情况;每日观察小鼠一般状态,体质量变化,糖水偏好实验和旷场实验探究小鼠行为学差异。结果:与空白对照组相比,模型组小鼠皮损鳞屑肥厚、浸润严重、红斑明显,PASI评分升高,表皮显著增厚、皮损中Ki67和CD3+T细胞表达水平显著增加(P<0.001);各治疗组小鼠背部皮损较模型组有明显改善,PASI评分和表皮厚度均显著低于模型组(P<0.05);各治疗组皮损中Ki67和CD3+T细胞表达水平均较模型组显著降低(P<0.05)。与空白对照组相比,模型组小鼠毛发凌乱、精神萎靡不振,一般状态差,造模前后体质量变化明显;糖水偏好率降低(P<0.01);在旷场环境中,其运动总路程、平均速度、中央区时间和中央区路程均降低(P<0.05)。而逍遥散各剂量组小鼠一般状态得到改善,糖水偏好率提高,其旷场行为学各项指标均上升。结论:逍遥散不仅缓解咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损,而且改善其抑郁行为。实验三 逍遥散治疗咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的机制研究目的:观察逍遥散对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型皮损中炎性细胞因子、炎症信号通路及抑郁相关神经递质的干预作用。方法:36只BALB/c雄性小鼠,背部备皮后,随机分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、甲氨蝶呤组(MTX)和逍遥散高、中、低剂量组(XH、XM、XL),每组6只,5%咪喹莫特乳膏背部涂抹诱导小鼠银屑病样皮损。高通量液相蛋白芯片检测皮损中炎性细胞因子的分泌;蛋白质印迹法(Western blot)检测皮损组织中核因子κB p65(Nuclear factor kappa-B,NF-κB p65)和丝裂原活化蛋白激酶 p38(p38 Mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)磷酸化水平。HPLC-MS 技术检测小 鼠前额皮质、海马区和下丘脑区脑组织DA、5-HT和Ad等神经递质的含量;Pearson相关和Spearman秩相关分析PASI评分与小鼠前额皮质、海马和下丘脑组织中DA、5-HT和Ad等含量的相关性。结果:与空白对照组相比,模型组小鼠皮损中IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-23和TNF-α的含量显著升高(P<0.01),IL-10含量显著降低(P<0.01),而逍遥散各剂量组上述炎性细胞因子的含量较模型组不同程度降低(P<0.05),IL-10含量显著升高(P<0.05)。模型组小鼠皮损中NF-κB p65和p38 MAPK磷酸化水平显著高于空白对照组(P<0.01),逍遥散低剂量组小鼠皮损中p38 MAPK磷酸化水平较模型组显著降低(P<0.05)。模型组小鼠不同脑组织中5-HT、Ad、NE和GABA等神经递质的含量低于空白对照组(P<0.05),逍遥散各剂量组小鼠不同脑区中5-HT和Ad的含量较模型组显著提高(P<0.05),Glu的含量降低(P<0.05)。银屑病样小鼠PASI评分与不同脑区中5-HT、NE、Ad和GABA的含量呈负相关。结论:咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损PASI评分与抑郁症相关神经递质的表达呈负相关,其抑郁程度随银屑病皮损的加重而加重;逍遥散可通过减少局部炎性细胞因子的释放,抑制皮损中NF-κBp65和p38MAPK的磷酸化,缓解银屑病炎症反应;同时上调抑郁症相关神经递质的表达水平,改善小鼠的抑郁状态。结语课题发现,咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型存在抑郁症表现,其抑郁程度与皮损严重程度呈负相关;逍遥散可通过抑制IL-17A、IL-23和TNF-α的分泌,促进IL-10的表达,抑制NF-κB和MAPK信号通路中p65和p38的磷酸化,减轻皮损炎症反应和表皮增殖,缓解银屑病样小鼠皮损;并上调银屑病样小鼠不同脑区中5-HT和Ad的含量,改善银屑病样小鼠的抑郁行为,在改善银屑病皮损的同时缓解抑郁症状。