心脑血管病是目前我国发病率、致残率和死亡率最高的疾病,而高血压是心脑血管病的主要危险因素之一。高血压病的发病机制复杂,有多种学说,如肾素血管紧张素醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)激活、交感神经系统活性增强、肾性水钠潴留、内皮细胞功能损伤等是高血压病主要学说。血管内皮细胞与平滑肌细胞构成血管壁的主要部分,在维持血管张力及维持血管正常生理功能中至关重要,故本研究主要以主动脉为载体,研究葛根素的降压机制。近些年来,越来越多的证据表明氧化应激及其相关的氧化损伤是影响血管张力,参与高血压病发生发展的主要原因之一。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)主要由血管内皮细胞、平滑肌细胞分泌,是合成一氧化氮(nitricoxide,NO)的特异酶,在维持血管舒缩功能、抗氧化损伤、保护内皮功能、抗血小板黏附聚集等多种生理病理过程中发挥作用。因此,研究eNOS及相关基因在降压及血管保护中的作用,对于高血压病的防治具有重要意义。近几十年来,高血压病的发病机制及抗高血压药物研究取得了一定进展,临床常用降压药在降低血压和防治靶器官损害等方面取得较好疗效。但也存在一些不足,如副作用多、终身服药、禁忌症多、部分药物联合使用受限等使药物的临床应用受到了一定限制,部分患者的血压指标不能令人满意。中医药对高血压病的研究取得了许多成果,得到了越来越多学者的关注,在调节机体整体平衡、控制血压水平稳定等方面发挥着独特的优势,其防治高血压病作用的多效性、增效减副性、多靶点性、前瞻性、稳定持久性均体现出了中医药特色。葛根始载于我国最早的中药学著作《神农本草经》中,距今已有近2000年历史。现代中药学在继承前人经验的基础上,将葛根归为解表药,认为其有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻的作用。葛根素注射剂的上市及临床应用是一重大突破。药理学发现,葛根素注射液有降低心肌耗氧量、扩张心脑血管、增强心肌收缩、改善微循环等功效,在冠心病、心肌缺血再灌注损伤、缺血性脑卒中、高血压病、老年性痴呆等心脑血管疾病的治疗中均发挥有效作用。本研究以自发性高血压大鼠为模型,主要研究葛根素注射液的降压机制。实验在第一部分借助qPCR阵列批量、精确的优势,初步筛选葛根素降压有效靶点。结果提示葛根素降压机制与增加eNOS活性、激活eNOS/cGMP通路密切相关。基于此,为进一步研究影响eNOS活性的因素,在实验第二部分,首先借助网络数据库,检索并得到与eNOS相关的基因,之后借助qPCR阵列技术,进一步研究葛根素降压及血管保护机制。本研究分为两部分:文献综述和实验研究。1文献综述:该部分从葛根的古今研究进展、葛根素防治高血压病的临床和基础研究进展、高血压与氧化应激三部分进行综述。2实验研究:包括以下两部分:研究一葛根素对自发性高血压大鼠血压的干预作用及机制初探目的:探讨葛根素对自发性高血压大鼠血压的干预作用及机制。方法:60只自发性高血压大鼠随机分为模型组(生理盐水,腹腔注射给药)、氯沙坦钾组(每天按32.5mg.Kg-1灌胃给药)、常规剂量葛根素组(每天按40mg·kg-1腹腔注射)和高剂量葛根素组(每天按80mg·kg-1腹腔注射),以Wistar-Kyoto(WKY)大鼠做为正常对照组(生理盐水,腹腔注射给药),每组15只,连续给药10周。每周对大鼠收缩压、舒张压及心率进行检测。超声心动图检测大鼠主动脉内径及心功能,以HE染色、马松染色观察药物对大鼠主动脉病理组织形态学影响,并检测大鼠血浆肾素-血管紧张素Ⅱ-醛固酮水平,以qPCR阵列技术检测主动脉高血压相关基因mRNA水平的变化,继而借助String及KEGG Pathway数据库对差异基因进行网络分析。用酶联免疫吸附法和免疫蛋白印迹技术验证目的基因在蛋白水平的变化。结果:模型组收缩压、舒张压较对照组明显升高(P<0.001);与模型组比较,高剂量葛根素组、氯沙坦钾组收缩压、舒张压均显著降低(P<0.05或P<0.01);给药9周后,模型组心率较对照组明显增加(P<0.05),高剂量、常规剂量葛根素组心率与模型组比较明显降低(P<0.01),氯沙坦钾组心率未见明显变化(P>0.05)。模型组主动脉内径较对照组明显增宽(P<0.001);氯沙坦钾组主动脉内径较模型组显著变窄(P<0.05),葛根素组较模型组未见明显差异(P>0.05),但有减小趋势。模型组EF值、FS值较对照组均明显降低(P<0.01);葛根素高剂量、常规剂量组EF、FS值较模型组明显升高(P<0.001),氯沙坦钾组较模型组差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠主动脉内中膜厚度较对照组明显增加(P<0.001);与模型组比较,氯沙坦钾组、葛根素高剂量、葛根素常规剂量组内中膜厚度均显著降低(P<0.001)。模型组血浆肾素、血管紧张素ⅡI水平与对照组比较均未见统计学意义(P>0.05);常规剂量、高剂量葛根素组血管紧张素Ⅱ水平较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01),且较氯沙坦钾组降低更为明显(P<0.01);氯沙坦钾组血管紧张素Ⅱ水平较模型组升高(P<0.05);与模型组比较,给药组均能显著降低大鼠血浆中肾素水平(P<0.01);各组间醛固酮水平未见明显统计学差异(P>0.05)。对qPCR阵列筛选得到的18个差异表达基因进行网络分析发现,eNOS与Cav1、Agtr1b关系密切;此外,Adrb1、Agtr1b、Gucy 1 a3、Gucy 1 b3、Kcnmal、Mylk、Mylk3、eNOS、Pde3a、Pde5a 均参与 cGMP/PKG通路的活化;Agtr1b、Gucy1a3、Gucy1b3、Kcnmal、Mylk、Mylk3、Ptgir 参与血管平滑肌收缩;Gucy1a3、Gucy1b3、Mylk、Mylk3、eNOS、Ptgir 均与血小板活化有关。用酶联免疫吸附法检测血清中cGMP、PGI2水平,发现模型组血清中cGMP、PGI2水平较对照组均明显下降(P<0.05);与模型组相比,氯沙坦钾组、高剂量及常规剂量葛根素组cGMP、PGI2水平均明显升高(P<0.01或P<0.001)。免疫蛋白印迹技术发现,模型组p-eNOS水平较对照组明显降低(P<0.01);与模型组比较,高剂量葛根素组p-eNOS水平明显升高(P<0.05),氯沙坦钾组无明显统计意义,但较模型组有升高趋势(P>0.05)。各组eNOS总蛋白表达量无明显差异(P>0.05)。模型组Agtr1蛋白表达量较对照组明显升高(P<0.01),氯沙坦钾、高剂量葛根素干预后能明显降低主动脉Agtr1蛋白水平(P<0.01)。各组间Agtr2蛋白水平无明显差异(P>0.05)。结论:葛根素降低自发性高血压大鼠血压,其机制与增加eNOS活性密切相关。葛根素通过下调Cav1、Agtr1b表达量,影响eNOS活性,此外eNOS/cGMP通路参与葛根素对血压的调节。研究二基于eNOS相关基因,进一步探讨葛根素的降压机制目的:基于eNOS在血压调控中的作用,探讨葛根素对主动脉的保护作用及机制。方法:自发性高血压大鼠随机分组后,分别给药葛根素和氯沙坦钾,连续给药10周后,以生化法检测大鼠血清中NO、MDA、O2..水平及SOD含量,酶联免疫吸附法检测大鼠血清中eNOS水平,以qPCR阵列技术检测主动脉eNOS互作基因的变化,继而借助String及KEGGPathway数据库对差异基因进行网络分析,并检测目的基因蛋白水平变化。结果:给药10周后,模型组血清NO水平较对照组显著降低(P<0.001),高剂量葛根素组、氯沙坦钾组大鼠NO水平较模型组显著升高(P<0.01或P<0.001)。与对照组比较,模型组MDA水平明显升高(P<0.001);与模型组比较,常规剂量、高剂量葛根素组和氯沙坦钾组MDA水平明显降低(P<0.01或P<0.001)。模型组O2-·水平较对照组显著升高(P<0.001),给药组各组间O2-·水平较模型组无明显差异(P>0.05),但有降低趋势。各组间SOD含量较模型组无明显统计学意义(P>0.05)。模型组血清eNOS水平较对照组明显降低(P<0.001),与模型组比较,氯沙坦钾组、高剂量葛根素组及常规剂量葛根素组eNOS水平明显增加(P<0.001或P<0.01)。对qPCR阵列筛选得到的12个差异表达基因进行网络分析发现,eNOS与HSP90β1、Cav1关系密切。此外,葛根素还影响Decr1、Gpx2、Prdx5、Prdx3等氧化酶的表达,参与PI3K/Akt、雌激素通路和黏着斑的调节。免疫蛋白印迹结果提示,模型组Hsp90蛋白表达水平较对照组明显升高(P<0.05),氯沙坦钾组、葛根素组Hsp90蛋白水平较模型组显著降低(P<0.05或P<0.001)。模型组与对照组比较,PI3K蛋白表达量无明显变化,但有降低趋势;氯沙坦钾、高剂量葛根素组PI3K蛋白表达量较模型组明显升高(P<0.001或P<0.01)。各组间Akt及p-Akt蛋白水平均无明显变化(P>0.05)。结论:葛根素可明显降低大鼠血清中MDA水平,升高NO、eNOS水平;eNOS活性受Hsp90、Hsp70及Nox调节。此外,葛根素通过增强抗氧化酶系统的防御功能,调控PI3K/Akt通路发挥抗氧化应激和降压作用。