【摘 要】
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背景:结直肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤。随着人们饮食习惯的改变以及医疗设备的不断改进,结直肠癌的发病率和死亡率近年来呈明显上升趋势。临床上,对于晚期结直肠癌患者主要采用以氟尿嘧啶类药物为基础的化疗方案。然而,氟尿嘧啶类药物之间存在交叉耐药性,且其具有心脏毒性。故临床上寻找可替代氟尿嘧啶类的化疗药物成为当务之急,在这种情况下,雷替曲塞（Raltitrexed,ZD1694,Tomudex;RTX）
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背景:结直肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤。随着人们饮食习惯的改变以及医疗设备的不断改进,结直肠癌的发病率和死亡率近年来呈明显上升趋势。临床上,对于晚期结直肠癌患者主要采用以氟尿嘧啶类药物为基础的化疗方案。然而,氟尿嘧啶类药物之间存在交叉耐药性,且其具有心脏毒性。故临床上寻找可替代氟尿嘧啶类的化疗药物成为当务之急,在这种情况下,雷替曲塞（Raltitrexed,ZD1694,Tomudex;RTX）作为一种新型的高选择性抗代谢类抗肿瘤药物,也是新一代水溶性胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase,TS）抑制剂,其与氟尿嘧啶类药物之间无交叉耐药性,且心脏毒性小。因其可作为5-FU的替代性单药,或联合治疗结直肠癌而备受人们关注。雷替曲塞在临床中表现出显著的抗肿瘤活性,但雷替曲塞抗结直肠癌的机制及生物学功能尚欠完善。目的:本项目拟通过体外实验进一步证实雷替曲塞诱导结直肠癌细胞增殖抑制、诱导结直肠癌细胞发生凋亡情况;阐明雷替曲塞诱导结直肠癌发生凋亡的同时细胞自噬发生的情况;进一步阐明雷替曲塞诱导的结直肠癌细胞自噬与其抗凋亡之间的关系（协同抑或拮抗）。通过本项目的实施有望完善雷替曲塞抗结直肠癌的机制及生物学功能。方法:（1）检测雷替曲塞诱导结直肠癌细胞的增殖抑制、诱导结直肠癌细胞发生凋亡情况:1)利用CCK-8法检测雷替曲塞在不同浓度或作用时间下对结直肠癌细胞SW480、HCT116两组细胞的增殖抑制情况;2)利用流式细胞术法检测雷替曲塞在不同浓度、不同时间下作用于结直肠癌细胞SW480的凋亡情况。（2）检测雷替曲塞在诱导结直肠癌细胞凋亡的同时是否诱导结直肠癌细胞自噬的发生:利用免疫印迹检测在不同浓度下的雷替曲塞分别诱导结直肠癌细胞SW480、HCT116两组细胞对LC3-II转化情况。（3）检测雷替曲塞诱导的结直肠癌细胞发生的细胞自噬对其抗癌效果的影响:1)利用细胞自噬抑制剂抑制雷替曲塞诱导的结直肠癌细胞自噬,通过CCK-8法检测雷替曲塞在不同浓度或不同作用时间下对结直肠癌细胞SW480、HCT116的增殖抑制情况;2)利用自噬抑制剂抑制雷替曲塞诱导的结直肠癌细胞SW480细胞自噬,通过流式细胞术法检测雷替曲塞在不同浓度或作用时间下对结直肠癌细胞的凋亡发生情况。（4）体外构建结直肠癌雷替曲塞耐药细胞株:利用体外低浓度梯度递增的方法构建耐药细胞株。以雷替曲塞作用于结直肠癌细胞的IC50（24h）的1/50为起始浓度开始给药。细胞生长至对数期后,将培养基更换为浓度比原来的雷替曲塞高20%的培养基,观察细胞约长满时传代,然后换用不含雷替曲塞的培养基继续培养;此后不断重复上述步骤,直至结直肠癌细胞在雷替曲塞IC50浓度中稳定。细胞连续培养7个月,共传代约50次。结果:（1）雷替曲塞诱导结直肠癌细胞增殖抑制、诱导结直肠癌细胞发生凋亡:1)CCK-8法表明:雷替曲塞在不同浓度或作用时间下对结直肠癌细胞SW480、HCT116两组细胞具有增殖抑制;2)流式细胞术表明:雷替曲塞在不同浓度、不同时间下诱导了结直肠癌细胞SW480凋亡。（2）雷替曲塞诱导结直肠癌细胞凋亡的同时诱导结直肠癌细胞自噬的发生:免疫印迹实验表明:不同浓度下的雷替曲塞分别诱导结直肠癌细胞SW480、HCT116两组细胞中LC3-II的明显转化。（3）雷替曲塞诱导结直肠癌细胞发生的细胞自噬拮抗了其抗癌效应:1)细胞自噬抑制剂抑制雷替曲塞诱导的结直肠癌细胞自噬后,CCK-8法表明:当雷替曲塞以不同浓度或不同作用时间作用于结直肠癌细胞SW480、HCT116后,结直肠癌细胞SW480、HCT116增殖抑制增强;2)自噬抑制剂抑制雷替曲塞诱导发生的结直肠癌细胞SW480、HCT116细胞自噬,流式细胞术表明:雷替曲塞在不同浓度或作用时间下诱导的结直肠癌细胞凋亡增强。（4）以结直肠癌细胞SW480和HCT116为模型成功构建了两组结直肠癌雷替曲塞耐药细胞株SW480-RTX和HCT116-RTX。结论:（1）雷替曲塞诱导了结直肠癌细胞增殖抑制、诱导了结直肠癌细胞凋亡;（2）雷替曲塞在抗结直肠癌细胞的同时诱导了细胞自噬;（3）雷替曲塞诱导结直肠癌细胞发生的自噬拮抗了其抗癌效应,提示细胞自噬可能是雷替曲塞发生耐药的分子机制之一;（4）通过构建结直肠癌雷替曲塞耐药细胞株（SW480-RTX、HCT116-RTX）,为后续结直肠癌雷替曲塞耐药的分子机制研究提供分子研究基础。
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