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牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）和牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是目前严重危害养牛业生产的重要病原。前者又名牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus-1,BoHV-1）,可以引起牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）,该病是一种以呼吸道炎、脑炎、结膜炎、流产和免疫抑制等为主要临床症状的传染病。后者可以导致牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）,并引发发热、黏膜糜烂、溃疡、腹泻、母畜流产或产生畸型胎儿等症状。疫苗接种是目前用于防控该两种疾病的有效方式,但是现有的疫苗多为灭活苗和弱毒苗,难以实现临床上自然感染与疫苗免疫的鉴别诊断,因此,开发具有血清学标记的二价重组疫苗具有很大的应用前景。E2蛋白是BVDV中和抗体的主要靶蛋白,而NS3蛋白在不同BVDV基因亚型之间具有很好的保守性,同时也是免疫优势蛋白之一。本研究探究了BVDV E2和NS3基因的表达条件,并使用实验室前期构建的BoHV-1 g G-/TK-双基因缺失苗株为载体,通过引入E2表达盒基因,构建了具有血清学标记的BoHV-1/BVDV二价重组疫苗。本研究的主要内容和结果如下:1.E2和NS3基因真核表达载体的构建及检测不同长度E2基因重组表达质粒的构建及表达检测:扩增1-945 nt、97-1017 nt、469-945 nt三种不同长度的1b型E2基因胞外区序列,并分别插入至pc DNA3.1-WPRE载体,再将该三种重组质粒转染至Hela细胞,通过Western blot检测E2基因在蛋白水平上的表达,结果显示三种长度的E2基因均无法成功表达。含E2基因以及g D-E2融合基因的六种表达载体的构建及表达检测:分别将Ig K信号肽以及g D基因胞外区序列与1b型E2基因胞外区序列、WPRE元件串联连接至含有CMV启动子的pc DNA3.1载体和改造后启动子为EF1α的pc DNA3.1载体,以及含有CMV IE启动子和内含子促表达序列的p CI-neo载体,再将该六种重组质粒转染至Hela细胞,通过间接免疫荧光检测E2基因及其串联基因在蛋白水平上的表达,结果显示以上条件及组合均不能表达E2及其串联基因。含不同信号肽以及不同E2基因亚型表达载体的构建及表达检测:成功将g B信号肽与1b型E2基因胞外区序列、E0信号肽与1b型E2基因胞外区序列、E0信号肽与1m型E2基因胞外区序列分别串联插入至pc DNA3.1-WPRE载体,再将该三种重组质粒转染至Hela细胞,通过间接免疫荧光检测E2基因在蛋白水平上的表达,并与上述构建的含有Ig K信号肽与1b型E2基因胞外区序列的pc DNA3.1-WPRE载体进行比较,结果显示在CMV启动子、g B信号肽以及WPRE等顺式作用元件的调控下,1b型E2基因可以在Hela细胞中进行蛋白水平上的表达。NS3基因真核表达载体的构建及表达检测:成功将g B信号肽和NS3基因、E0信号肽和NS3基因、Ig K信号肽和NS3基因、Ig K信号肽和去除了非免疫原性序列的NS3基因分别串联插入至pc DNA3.1-WPRE载体,再将该四种重组质粒转染至Hela细胞,通过间接免疫荧光检测NS3基因在蛋白水平上的表达,结果显示在上述条件下,NS3基因无法成功表达。2.重组病毒BoHV-1 g G–/TK–/E2+的构建将E2表达盒基因进行扩增,并插入至转移载体pc DNA3.1-TK,在与病毒基因组BoHV-1 g G–/TK–/EGFP+共转染至MDBK细胞时对转染的条件进行了探索,发现磷酸钙转染比脂质体转染更加合适,且合适的病毒基因组以及线性化载体质粒的用量是转染成功的关键因素。3.重组病毒BoHV-1 g G–/TK–/E2+的筛选及鉴定转染后的病毒液需要进行挑斑纯化。经过两轮的盲挑后,提取盲挑产物的基因组并选择有E2基因拷贝的病毒液再进行四轮的病毒挑斑纯化,最终得到纯净的BoHV-1 g G–/TK–/E2+病毒培养物并通过PCR验证了该培养物中无EGFP基因的拷贝以及E2表达盒基因成功插入至病毒基因组中。随后通过PCR和间接免疫荧光分别检测重组病毒在MDBK细胞中对E2基因在RNA水平和蛋白水平上的表达,结果发现重组病毒BoHV-1 g G–/TK–/E2+能对E2基因进行转录,但是不能检测出E2基因以及与E2基因串联的HA标签基因在蛋白水平的表达。4.重组病毒BoHV-1 g G–/TK–/E2+生长特性的研究在研究wt BoHV-1、BoHV-1 g G–/TK–/E2+、BoHV-1 g G–/TK–/EGFP+毒株各30个空斑的大小时发现wt BoHV-1的空斑显著大于BoHV-1 g G–/TK–/E2+的空斑（p＜0.001）,BoHV-1 g G–/TK–/E2+的空斑显著大于BoHV-1 g G–/TK–/EGFP+的空斑（p＜0.001）。在绘制病毒生长曲线时发现,重组病毒BoHV-1 g G–/TK–/E2+和wt BoHV-1的生长趋势基本一致,并与BoHV-1 g G–/TK–/EGFP+有一定的差异。结论:使用CMV启动子、g B信号肽以及WPRE等顺式作用元件,构建了重组质粒pc DNA3.1-Sg B-E2（1b）-WPRE和重组病毒BoHV-1 g G–/TK–/E2+,并能分别在Hela细胞和MDBK细胞中表达E2基因,同时研究发现外源基因E2的插入导致病毒的生长特性改变且空斑直径显著增大。此研究为具有血清学标记的BoHV-1/BVDV二价疫苗的开发提供了基础依据。