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背景脑血管病严重威胁人类健康,其中脑卒中是最常见的脑血管病。目前在我国,因脑卒中导致的死亡已占死亡原因的首位,我国人口老龄化日益加剧,脑卒中必将成为威胁老年人健康的主要杀手。脑卒中患者中缺血性脑卒中居多。缺血性脑卒中发生时,脑组织缺血中心区神经组织很快因缺血缺氧而发生不可挽回的梗死,但在缺血中心区周围的缺血半暗带区神经组织只是部分缺血缺氧,在一定时间内只是处于病理损伤的早期阶段,其中的神经元多呈现细胞水样变性,既有加重死亡的趋势,又有逆转恢复正常的可能。因此,寻找神经细胞自我保护机制,延长半暗带区细胞存活时间,适当扩大治疗时间窗,为患者后续治疗赢得时间是目前亟待解决的实际问题。近年来许多研究表明,自噬作为一种细胞自救机制,在生理和应激条件下都发挥着重要作用。但缺血时自噬的作用机制不明确,发挥促进存活还是加剧损伤作用也存在争议。神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y作为体外细胞模型用来研究神经元损伤是学术界公认的,因此,本课题选用SH-SY5Y作为体外细胞模型,模拟缺血半暗带的缺氧缺糖环境,通过观察细胞微丝、线粒体变化,检测细胞凋亡、坏死、自噬情况,全面反映神经细胞的损伤变化,揭示神经元自我救赎机制,为临床上进一步扩大缺血性脑卒中治疗时间窗、促进康复提供实验依据。目的研究在缺血缺氧条件下神经细胞SH-SY5Y的损伤情况,观察Beclin1蛋白在缺血缺氧条件下对神经元自噬的作用以及对细胞抗损伤的影响;观察线粒体变化与神经元自噬的关系以及在缺血缺氧致SH-SY5Y细胞损伤中的作用;观察微丝变化与神经元抗损伤活动的关系,以期寻找影响神经细胞自救的因素,为保护半暗带神经元提供依据。方法采用神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行培养,糖氧剥夺(OGD)模拟半暗带区缺血缺氧环境,应用RNA干扰(RNAi)技术构建Beclin1-siRNA干扰模型,下调Beclin1的转录和翻译水平,从而下调自噬。观察缺血缺氧对SH-SY5Y损伤的实验,具体分为三组:对照组、OGD 6 h组、OGD 24 h组。观察自噬在缺血缺氧SH-SY5Y损伤中的作用,具体实验分为四组:对照组、RNAi组、OGD 6 h组以及RNAi+OGD 6 h组。RT-PCR、Western Blot法对Beclin1-siRNA干扰模型进行鉴定;采用CCK-8法检测细胞活力;微板比色法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量;特异性荧光探针标记细胞微丝、线粒体,荧光显微镜下观察微丝皮质层、应力纤维变化,线粒体分布、数量和形态改变;DCFH-DA荧光探针标记活性氧(ROS),流式细胞仪、荧光显微镜观察ROS变化;间接免疫荧光标记LC3蛋白,Western Blot检测Beclin1、LC3、P62自噬相关蛋白,评价细胞自噬情况;Hoechst33258/PI观察细胞坏死情况;DAPI染色和Annexin V-FITC/PI分别观察细胞核形态、检测细胞凋亡水平,Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白表达情况采用Western Blot检测。结果1.缺血缺氧条件下神经细胞SH-SY5Y的变化与对照组相比随OGD时间延长,细胞的活力逐渐下降,LDH溢出逐渐增多;OGD 6 h组较对照组细胞微丝皮质层变薄,应力纤维减少,OGD 24 h后微丝损伤加重甚至出现凝集现象;线粒体总数减少,呈线状的线粒体减少,呈点状的线粒体增多,绕细胞核周分布;流式细胞术、荧光显微镜结果均显示随OGD时间延长,细胞内ROS水平逐渐升高;OGD处理后Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对增多,反映自噬降解水平的P62表达下降,免疫荧光结果同样显示LC3-Ⅱ亮点增多,OGD后自噬水平上调且自噬流通畅;Hoechst33258/PI双染结果显示,与对照组相比OGD后细胞呈现亮蓝色、红染,说明坏死细胞增多;凋亡方面,经DAPI染色后OGD 6 h组的细胞核染色质边缘凝集,OGD 24 h后形态变化更加明显,从整体上检测细胞凋亡率显示OGD时间延长细胞凋亡率逐渐增加。2.Beclin1-siRNA转染效果检验Beclin1-siRNA干扰后基因水平和蛋白水平检测均显示,Beclin1水平明显下调,干扰成功。3.RNAi下调Beclin1水平缺血缺氧条件下SH-SY5Y的变化RNAi+OGD 6 h组与OGD 6 h组相比,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显减少,P62增多,自噬水平显著下调,但RNAi+OGD 6 h组自噬水平仍高于对照组;较OGD 6 h组,RNAi+OGD 6 h组细胞的活力下降明显,线粒体数量减少,微丝皮质层变薄,应力纤维进一步减少,坏死细胞增多,细胞凋亡率增加,Bax明显增多,Bcl-2减少。结论缺血缺氧导致神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y发生损伤;Beclin1依赖的自噬对缺血缺氧神经细胞SH-SY5Y具有保护作用。