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人毛囊间充质干细胞（human Hair Follicle Mesenchymal Stem Cells,hHFMSCs）具有易获取、安全和免疫原性低等特点,有望成为再生医学领域的种子细胞来源之一。然而,hHFMSCs经一定时间体外培养后失去维持自我更新能力,衰老细胞增多,极大程度上限制hHFMSCs的应用。因此,深入了解hHFMSCs自我更新和衰老的细胞生物学机制,为hHFMSCs在再生医学,特别是个体化细胞疗法的应用提供理论和实验依据。干细胞维持自我更新表现为维持细胞的增殖状态和多向分化潜能,细胞不发生分化。目前认为,干细胞自我更新的调节以OCT4、SOX2和NANOG为中心的转录调控网络和DNA甲基化等表观遗传修饰共同抑制分化基因并激活干性基因。其中,OCT4作为最上游的转录因子之一,在维持自我更新中起关键作用。OCT4可以消除G1阻滞并刺激细胞进入S期,促进G1/S转换。这是一种独特的细胞周期进程,是干细胞自我更新所必须的。作为调控细胞周期进程的关键点,G1/S转换主要受G1调节分子的调节,这些调节分子中,p21是通用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitors,CDKI）的成员,并且在调节G1/S转换中起关键作用。同时,作为衰老的标志基因,p21在调控细胞衰老的过程中起关键作用。由于p21启动子区含有高密度的潜在甲基化CpG岛,p21基因转录水平受DNA甲基化调节。有趣的是,研究发现,DNA甲基化转移酶（DNMT1、DNMT3a和DNMT3b）的启动子区存在OCT4结合位点,OCT4可转录调控DNMTs的表达。由此推测,OCT4转录激活DNMTs,促进p21启动子区DNA甲基化,抑制p21表达,从而维持细胞的自我更新并抑制衰老。目的探讨OCT4通过DNMTs/p21信号维持hHFMSCs自我更新和抑制细胞衰老的作用及机制。方法一、OCT4对hHFMSCs自我更新能力和衰老的影响1.过表达OCT4的hHFMSCs(hHFMSCsOCT4)的建立及验证:利用慢病毒载体过表达OCT4;RT-qPCR、western bolt及流式细胞术检测hHFMSCsOCT4中OCT4的表达;免疫荧光法检测OCT4的表达和定位。2.OCT4对hHFMSCs自我更新能力的影响细胞动态监测仪、细胞计数法、二维克隆形成和成球实验检测hHFMSCs增殖能力;流式细胞术检测细胞周期;western blot检测增殖相关蛋白PCNA和cyclin D1的表达;免疫荧光法检测Ki67的表达;成骨分化诱导实验检测成骨分化潜能;RT-qPCR检测分化相关基因的表达。3.OCT4对hHFMSCs衰老的影响透射电镜检测OCT4对细胞超微结构的影响;SA-β-gal实验检测β-半乳糖苷酶表达;RT-qPCR检测衰老相关基因p21、p16和hTERT的表达。二、OCT4维持hHFMSCs自我更新能力并抑制衰老的机制1.OCT4对基因表达谱的影响利用NGS,筛选hHFMSCsEGFP和hHFMSCsOCT4差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）;GO分析富集基因功能;KEGG分析富集信号通路。2.OCT4下调p21维持hHFMSCs自我更新并抑制衰老在hHFMSCsOCT4中,利用慢病毒载体过表达p21,通过RT-qPCR和western blot进行鉴定;CCK8和二维克隆形成实验检测hHFMSCsOCT4增殖;western blot检测PCNA和cyclin D1的表达;免疫细胞化学检测Ki67的表达;成骨分化诱导实验检测成骨分化潜能;SA-β-gal实验检测β-半乳糖苷酶表达;RT-qPCR检测p16和hTERT的表达。3.OCT4调节p21表达的方式利用RT-qPCR和western blot检测hHFMSCsOCT4中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达;ChIP实验检测OCT4调节与DNMT1、DNMT3a和DNMT3b启动子区结合情况;甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR,MSP）检测p21启动子区DNA甲基化状态。4.OCT4通过DNMTs/p21信号维持hHFMSCs自我更新并抑制衰老抑制剂5-aza-dC/zebularine处理后,western blot检测DNMTs以及p21的表达;MSP检测p21启动子区DNA甲基化状态;CCK8和二维克隆形成实验检测hHFMSCsOCT4的增殖;流式细胞术检测细胞周期;western blot检测PCNA和cyclin D1的表达;免疫荧光技术检测Ki67的表达和定位;成骨分化诱导实验检测成骨分化潜能;RT-qPCR检测分化相关基因的表达;透射电镜检测细胞超微结构;SA-β-gal实验检测β-半乳糖苷酶表达;RT-qPCR检测p16和hTERT的表达。结果一、OCT4对hHFMSCs自我更新能力和衰老的影响1.过表达OCT4的hHFMSCs(hHFMSCsOCT4)的建立及鉴定成功获得过表达OCT4的hHFMSCs;hHFMSCsOCT4中高表达OCT4,主要定位于细胞核。2.OCT4对hHFMSCs自我更新能力的影响OCT4促进hHFMSCs增殖和细胞周期进程;上调PCNA、cyclinD1和Ki67的表达,表明OCT4促进hHFMSCs的增殖;促进细胞成骨分化潜能;抑制分化相关基因的表达,表明OCT4维持hHFMSCs自我更新。3.OCT4对hHFMSCs衰老的作用透射电镜显示,hHFMSCsOCT4细胞增殖旺盛,状态良好;OCT4抑制SA-β-gal的表达;下调p21和p16的表达,上调hTERT的表达,抑制hHFMSCs衰老。二、OCT4维持hHFMSCs的自我更新并抑制衰老的机制1.OCT4对基因表达谱的影响GO分析结果显示,上调的DEGs显著富集于细胞周期的G1/S转换;KEGG分析结果显示,上调的DEGs主要富集在细胞周期。提示,OCT4维持hHFMSCs自我更新和抑制衰老与细胞周期有关,并选出下游基因p21作为后续研究对象。2.OCT4下调p21维持hHFMSCs自我更新并抑制衰老过表达p21的hHFMSCsOCT4,细胞的增殖、二维克隆形成能力明显被抑制;PCNA和Ki67表达下调,cyclin D1表达水平无明显变化;成骨分化能力明显抑制;SA-β-gal染色阳性细胞显著增多;p16表达上调,hTERT表达下调。说明,OCT4是通过下调p21维持hHFMSCs自我更新并抑制衰老。3.OCT4调节p21表达的方式过表达OCT4后,DNMTs表达显著上调;ChIP实验结果显示OCT4与DNMTs的启动子区结合;MSP结果显示过表达OCT4后p21启动子区DNA甲基化水平明显升高。表明,OCT4通过转录激活DNMTs,抑制p21的表达。4.OCT4通过DNMTs/p21信号维持hHFMSCs自我更新和抑制衰老抑制剂5-aza-dC/zebularine处理细胞后,DNMTs表达下调,p21表达上调;p21启动子区DNA甲基化水平下调。hHFMSCsOCT4增殖明显被抑制;细胞周期发生阻滞;成骨分化潜能明显抑制;分化相关基因表达上调;电镜和SA-β-gal染色结果显示衰老细胞增多;p21和p16表达显著上调,而hTERT表达下调。以上结果表明,OCT4维持hHFMSCs自我更新并抑制衰老是通过转录激活DNMTs,抑制p21的表达实现的。结论1.OCT4促进hHFMSCs的增殖和成骨分化潜能,维持自我更新能力,同时抑制细胞衰老。2.OCT4与DNMT1、DNMT3a和DMMT3b的启动子区结合,上调DNMTs,抑制p21表达,进而维持hHFMSCs的自我更新并抑制衰老。