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口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD )是由口蹄疫病毒(FMD virus, FMDV)感染偶蹄动物引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV的抗原易发生变异,因此到目前还没有有效的预防措施。FMDV的4种结构蛋白中VP4几乎不发生变异。并已证明,FMDV结构蛋白1A(VP4)富含T细胞抗原表位与B细胞抗原表位的抗原分子。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前发现的功能最强大的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)。实验证明,FMDV野毒株并不感染DC,但在培养基上驯化的FMDV却可以感染DC,并且与抗体结合后的FMDV也可以感染DC,导致其抗原提呈功能丧失,而当DC负载灭活FMDV免疫复合物后却能够有效地刺激T细胞。而细胞免疫应答在抗病毒感染过程中发挥重要作用。被DC活化的T细胞在IL-12的作用下,可分化为Th1细胞,介导细胞免疫应答并产生调理性抗体(IgG),从而清除胞内病原体感染。而在IL-4的作用下,有利于Th细胞向Th2细胞分化,介导体液免疫应答,产生中和抗体,清除外周循环中的病原体。目前尚不清楚DC启动细胞免疫应答的机制。本研究根据农业部2008年12月12日发布的《动物病原微生物实验活动生物安全要求细则》,既不使用活病毒,也不使用灭活病毒,首先按照GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒的核苷酸序列合成pBluescriptⅡSK(+)-VP4,然后将pBluescriptⅡSK(+)-VP4通过BamHI和XhoI位点插入到pET-32a(+)原核表达载体,构建VP4的原核表达载体pET-32a-VP4。将VP4表达载体转化宿主菌BL21,制备工程菌进行原核表达。通过对诱导表达条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件,利用载体的His-Tag标签做Western blot鉴定。通过电洗脱纯化VP4蛋白质抗原。将荷载了FMDV VP4蛋白质抗原的DCs与淋巴结T细胞共培养,并以DCs+T细胞和DCs作为对照组,在共培养3h,9h,24h和48h后,取其共培养上清液,ELISA检测其中IFN-γ和IL-4的水平,从而研究FMDV VP4蛋白质抗原对T细胞的活化效应。本研究构建的原核表达载体pET-32a-VP4经BamHI和XhoI双酶切,得到了符合预期大小的特异性片段,测序结果与GenBank中Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NYOO基因编码VP4序列完全一致,同源性为100%,证明原核表达载体pET-32a-VP4构建成功。SDS-PAGE检测宿主菌BL21表达目的蛋白的结果显示:在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导后5 h时表达量最大。经Western blot鉴定其在25kDa处有杂交条带,与预期目的蛋白大小相符。细胞共培养ELISA检测结果显示,负载FMDV VP4的DC能够有效地激活淋巴结T细胞。这些结果不仅为进一步研究DCs对FMDV VP4抗原的提呈途径打下了基础,而且为新型疫苗设计与开发提供理论指导。