茶树内生草螺菌WTOOC(Herbaspirillum sp.WT00C)是本实验室从野生茶树中分离获得一株茶树特异性内生革兰氏阴性细菌。它的微生物学性质、生理生化性质、分类鉴定以及茶树促生作用都进行过较深入的研究,其基因组也已解序。基因组分析发现该内生菌拥有完整的硒代谢途径。为了证实茶树内生草螺菌WT00C的硒酸盐还原能力和探索是否可利用该细菌促进茶叶富硒,本项目就草螺菌WT00C的硒酸盐还原、硒还原的最佳条件、还原硒产物的性质以及改善茶树硒富集等方面展开研究。经过三年的努力,获得如下主要结论:1.茶树内生草螺菌WT00C具有较强的硒酸盐耐受性。当草螺菌WT00C在含硒酸钠的LB培养基中培养时,细菌生长表现抑制现象且抑制作用随着硒酸盐浓度的升高而增强。当培养基中的硒酸盐浓度达到200 mM时,12小时培养期间内细菌生长受到严重抑制,但12小时后细菌细胞恢复生长并且在48小时时接近不含硒酸盐对照组的细菌生长水平。活菌检测发现12小时培养期间内的细菌仍然存活,表现出较强的硒酸盐耐受性。通过条件优化发现,在温度为37℃和转速为200rpm条件下,草螺菌WT00C还原硒酸钠最佳。2.茶树内生草螺菌WT00C能有效地将硒酸盐还原生成红色的元素硒。当草螺菌WT00C与硒酸盐共培养,它能有效地将硒酸盐还原生成红色的元素硒,并将固体平板上的细菌菌落或液体培养基变成红色。透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)揭示细菌代谢产生了硒纳米颗粒(SeNPs)。分布在细胞表面的硒纳米颗粒虽然大小不一(<10 nm),但随着时间的推移越长越大,硒纳米球从10、100 nm生长至200 nm,最终结晶形成直径1μm的硒纳米花。X射线能谱仪(EDS)映射定位了元素硒主要在硒纳米球中分布,并且X射线衍射仪(XRD)分析结果证实草螺菌WT00C确实将硒酸盐(Se6+)还原成元素硒(Se0)。通过蔗糖密度梯度离心,分离纯化出高纯度的红色纳米球。生化分析表明,除了元素硒外硒纳米球还含有细菌的蛋白质,但没有还原糖和脂类物质。在相同条件下分别将细菌细胞质和细胞壁组分与硒酸盐共培养,发现细菌细胞质组分比细胞壁组分硒酸盐还原活性高。这些实验结果提示,硒酸盐还原反应主要发生在草螺菌WT00C的细胞质内,形成的细小硒纳米颗粒穿过细胞壁分泌至胞外。硒纳米颗粒聚集形成硒纳米球后,经过彼此融合形成较大的纳米球,最后在特定条件下结晶形成硒纳米花。3.茶树内生草螺菌WT00C能有效促进茶叶硒富集。由于内生细菌具有较强的硒酸盐还原能力,我们推测它可能促进茶叶的硒富集。为了验证这一假设,我们采用注射和浸泡扦插苗两种方式将细菌接种到茶苗中。将苗移栽至含有0-3.5 mg/kg的硒酸盐土壤后,在自然条件下生长并在不同时间内采样检测硒含量。结果发现该内生细菌显著增强茶叶的硒富集。在注射接种中,三个实验组随着培养时间的增加,根、茎和叶中硒含量都有所增加,表明茶树本身能够富集一定量的硒。不过,实验组茶树和对照组根和茎中硒的分布并没有明显的差异,但是与各自对照组相比三个实验组在不同时间段采集的茶叶中则显示显着的硒富集。例如在0.622、1.5和3.5 mg/kg的硒酸盐土壤中培养的茶树,注射接种150日后三个实验组茶叶中硒含量分别为1.182、11.224和36.236 mg/kg,而三个对照组茶叶中硒含量分别为0.454、4.060和15.154 mg/kg。与注射接种法相同,以浸泡方式接种的茶树150日后三个实验组茶叶中硒含量分别为4.586、18.394和38.704 mg/kg,而三个对照组茶叶中硒含量则分别为1.967、7.110和15.228 mg/kg。每个实验组硒含量都是相应对照组的2倍。统计学分析表明实验组与对照组之间的P值<0.001,呈极显著的统计学差异。通过本项目的研究,不仅证明了茶树内生草螺菌WT00C确实具有较强的硒酸盐还原能力而且发现了它能有效地促进茶叶硒富集。同时,首次发现硒纳米球通过融合方式逐渐增大体积。此外,利用浸泡扦插杆接种细菌生产寄宿内生草螺菌WT00C的茶苗技术相对简便易行,适合茶场大面积使用。利用茶树内生草螺菌WT00C促进茶叶硒富集的研究不仅为茶农生产富硒茶叶提供了新的策略而且提供了技术支撑。