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目前,各类恶性肿瘤仍然是影响人类健康甚至危及生命的主要疾病。据研究数据统计,截止到2018年,大约有1810万恶性肿瘤新发病例和960万恶性肿瘤死亡病例在全球范围内产生。在中国,肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌等仍高居于恶性肿瘤的前五名。从短时间内来看,手术、放疗和化疗等这些传统的肿瘤治疗方法能取得较好的效果,可是因为肿瘤细胞的本身特质,即肿瘤细胞自身会携带对人体有害的毒副物质,这些毒副物质通常会导致肿瘤细胞的转移率和复发率的增加,此外存在在人体内的肿瘤细胞也会对人体自身特别是人体内整个制造血液的系统和整个能够执行免疫应答以及免疫功能的系统造成一定程度的损伤。所以传统的肿瘤治疗方法如放射治疗和化学药物治疗对于已经发生肿瘤转移的患者较难达到预期较好的远期疗效。但是随着肿瘤分子机制研究的进一步发展,通过基因转移技术将外源基因导入靶细胞治疗肿瘤的基因治疗方法得到了广泛的应用。目前,随着肿瘤基因治疗时代的到来,以载体为切入点的实验开发也应运产生。通常可以将应用的载体分为2大类,分别是病毒载体和非病毒载体。因为病毒更容易侵入人体细胞,影响宿主基因的转录和翻译,所以病毒载体较非病毒载体而言应用更为广泛。本研究中将腺病毒（Adenovirus,Adv）作为载体,让其携带外源基因α1,3半乳糖基转移酶（α1,3 galactosyltransferase,α1,3GT）,而我们所需的α半乳糖基抗原（α-Galactosidase,α-Gal）表位是在α1,3GT的刺激作用下产生的。本研究中,在人端粒酶逆转录酶（Human telomerase reverse transcriptase,h TERT）启动子的作用下,α-Gal在肿瘤细胞膜表面合成,放大肿瘤细胞的肿瘤相关抗原（Tumor associated antigen,TAA）的免疫原性,从而特异性的激发机体的细胞免疫和体液免疫,并且通过将抗原呈递给淋巴组织,以此来产生稳定高效的CD4/CD8 T细胞反应,抑制肿瘤细胞生长并进一步产生杀伤肿瘤的效应。早期区1A基因（Early region 1A,E1A）作为一个抑癌基因可以双向调控多种基因的表达,它的机理是通过依赖或者非依赖抑癌基因p53这条途径来诱导细胞的程序化死亡和调控细胞周期,使细胞滞留在G1及G2期。研究表明E1A基因是肿瘤抑制因子,也就是说它可以作为抑癌基因在抗肿瘤治疗方面发挥作用同时对正常细胞没有致癌性。E1A基因的肿瘤抑制作用可能与其调控多种基因的机理有关。有实验已经证明它能够通过多种途径抑制肿瘤的生长、侵袭及转移,与此同时还能够提高NK细胞、细胞毒T淋巴细胞、巨噬细胞的发挥杀伤作用的效力。目前已知E1A基因通过了美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）的批准,并且在临床试验中也取得了非常积极的疗效。因此将E1A基因应用在临床中对改善癌症患者的生存质量、提高生存率及延长生存期都可能有非常重要的意义。人端粒酶逆转录酶在85%的人类肿瘤组织中呈阳性表达。作为可以特异驱动治疗基因在肿瘤细胞中表达,h TERT启动子可以实现肿瘤基因治疗的靶向性,从而减小在治疗过程中对正常组织带来的毒副作用。所以作为理想的肿瘤靶向治疗基因的启动子,h TERT启动子可启动某些基因如α1,3GT和E1A只在肿瘤细胞中复制和表达。因此选择腺病毒作为载体,通过构建合适的,并获得高效表达的外源基因α1,3GT和E1A重组腺病毒载体,以期包装出具有杀伤肿瘤能力的溶瘤腺病毒,为探寻有效的肿瘤靶向治疗新药物提供研究基础。目的:利用Gateway技术构建了三种重组腺病毒载体p Ad-h TERT-α1,3GT-E1A-EGFP、p Ad-h TERT-α1,3GT-EGFP、p Ad-h TERT-E1A-EGFP,并利用脂质体转染的方法包装出重组腺病毒Ad-h TERT-α1,3GT-E1A-EGFP、Adh TERT-α1,3GT-EGFP、Ad-h TERT-E1A-EGFP。方法:本研究首先为扩增所需的每个目的基因都设计了一对特异性引物,然后利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增每个目的基因。接着通过同源重组反应这一传统的克隆方法将目的基因h TERT-α1,3GTEGFP、E1A、h TERT-E1A-EGFP克隆进入门载体p Entry,从而构建出入门克隆p Entry-h TERT-α1,3GT-E1A-EGFP、p Entry-h TERT-α1,3GT-EGFP、p Entryh TERT-E1A-EGFP。入门克隆构建完成后,将含有目的基因的入门载体和目的载体p Ad以及Gateway LR Clonase酶混合,构建表达克隆p Ad-h TERT-α1,3GT-E1A-EGFP、p Ad-h TERT-α1,3GT-EGFP、p Ad-h TERT-E1A-EGFP。使用脂质体转染的方法在人胚肾细胞（Human Embryonic Kidney 293 cell,HEK293）中转染重组质粒,包装出重组腺病毒Ad-h TERT-α1,3GT-E1A-EGFP、Ad-h TERT-α1,3GT-EGFP、Ad-h TERT-E1A-EGFP。运用逆转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）鉴定病毒。用重组腺病毒感染不同的肿瘤细胞,当感染一段时间发现细胞形态略微改变后,利用相应的抗体和细胞孵育,通过间接免疫荧光试验验证重组腺病毒在肿瘤细胞中的表达能力。利用CCK-8检测重组腺病毒对肿瘤细胞的抑制作用。结果:使用特异性引物,目的基因在PCR中得到了扩增。使用同源重组的方法和LR反应分别构建出了入门克隆和重组腺病毒载体。借助脂质体转染的方法,将重组腺病毒载体导入目标细胞,包装出了重组腺病毒。间接免疫荧光试验说明重组腺病毒能在肿瘤细胞中大量表达。通过CCK-8实验验证,重组腺病毒Ad-h TERT-α1,3GT-E1A-EGFP对人肿瘤细胞有抑制作用。结论:本研究构建并包装出了重组腺病毒Ad-h TERT-α1,3GT-E1A-EGFP,为今后体内和体外的深入研究奠定了基础。