肿瘤坏死因子受体-Fc抗体融合蛋白(TNFR-Fc抗体融合蛋白)在治疗风湿性、类风湿性关节炎方面具有明显的疗效,拥有广阔的市场前景和巨大的经济价值。但是由于动物细胞表达抗体融合蛋白能力低,以及现有培养工艺和培养规模的局限,目前TNFR-Fc抗体融合蛋白的产能不能满足病患者对其日益增长的需求。因此针对表达TNFR-Fc抗体融合蛋白的GS-CHO细胞,建立经济、高效的流加培养和灌注培养过程,满足制药企业对药品生产过程低成本、高产能和经济性的诉求,是TNFR-Fc抗体融合蛋白成功迈向产业化过程中一项必不可少的工作。在GS-CHO细胞培养过程中,营养物耗竭和代谢副产物累积所导致的培养环境恶化和宿主细胞抗体融合蛋白表达能力低下是限制/抑制细胞生长和产物表达的主要问题。为此深入认识GS-CHO细胞生长、代谢和产物合成特性,了解培养环境对细胞生理状态和产物合成的影响,是解决上述问题的前提,也是本文研究工作的核心所在。首先,本文通过37℃批式培养和流加培养实验系统研究了GS-CHO细胞的生长、代谢和产物表达特性。实验发现培养液中葡萄糖浓度对细胞生长、代谢及产物表达起重要作用。当葡萄糖浓度大于15 mmol/L时其利用率较低,乳酸的平均比生成速率和单位葡萄糖消耗的乳酸平均得率最大,分别为9.99 mmol/(109cells-day)和1.49 mmol/mmol,导致乳酸大量累积,从而加速培养环境的恶化；而当葡萄糖浓度低于5 mmol/L时,乳酸生成受到一定程度的限制,其比生成速率仅为1.01 mmol/(109cells-day),但同时也限制了细胞生长及产物表达；当葡萄糖浓度维持在5-15 mmol/L时,其余营养物质(氨基酸和磷酸根等)的比消耗速率基本保持不变,细胞生长及产物合成不受限制,细胞平均比生长速率与抗体融合蛋白的平均比生成速率分别为0.7day-1和5.67 mg/(109cells-day),且能有效地控制乳酸的生成。另外,通过测定和分析培养过程中氨基酸、磷酸根等营养物的消耗,发现基础培养基中的营养物浓度配比与其比消耗速率不够均衡,不能满足高密度、长时间维持过程中细胞对营养物的需求,其中亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸和磷酸根的比消耗速率相对较大。在研究过程中发现温度对GS-CHO细胞生长、代谢和产物表达具有显著影响,为此本文开展了三种培养温度(30℃、33.5℃和37℃)条件下的批式培养和细胞生长-维持两阶段温度分别控制的流加培养实验。结果表明,随着培养温度的降低,细胞的比生长速率下降,特别在30℃培养条件下细胞生长完全受到抑制,细胞群体中处于G1/G0期的细胞比例、细胞干重以及单个细胞蛋白质、碳水化合物、脂类和核酸质量等均有不同程度的提高。另外实验也发现,低温(30℃)条件下营养物如葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸和磷酸根的比消耗速率以及代谢副产物如乳酸、氨和丙氨酸的比生成速率明显降低,精氨酸和苏氨酸的比消耗速率却比37℃时提高了2.7倍和0.9倍,而其他营养物的比消耗速率基本保持不变。在上述实验基础上通过代谢途径流量分析,发现低温(30℃)条件下葡萄糖比消耗速率、进入糖酵解途径和磷酸戊糖途径的绝对流量与常温条件相比显著降低,但葡萄糖进入TCA循环的比例提高了125%,由丙酮酸生成代谢副产物乳酸的绝对流量从常温(37℃)培养时的0.765 mmol C/(109cells-day)锐减至低温(30℃)培养时的0.053 mmol C/(109cells-day),降幅达90%。此外氨基酸参与细胞合成和生成代谢副产物丙氨酸的绝对流量减少,而用于抗体融合蛋白合成的绝对流量比常温(37℃)条件下提高了3-5倍。能量代谢分析也表明30℃时,细胞处于产能效率最高的状态,经氧化磷酸化途径生成ATP所占比例最高,为96.8%。由此可见,采用低温(30℃)培养方式能显著提高营养物的利用效率和能量代谢效率,抑制代谢副产物乳酸和丙氨酸的生成,能有效缓解营养物耗竭和代谢副产物累积的矛盾。在抗体融合蛋白表达方面,其比生成速率随着培养温度的降低而明显提高,30℃时其比生成速率最高,为18.64±1.46mg/(109cells-day),比常温条件(37℃)提高了200%。进一步研究表明,低温(30℃)条件下GS-CHO细胞的抗体融合蛋白表达水平提高与产物目的基因mRNA转录水平的上调有密切关系,而且两者随着培养过程中活细胞密度的提高呈现显著下降,其中高密度维持培养的抗体融合蛋白比生成速率远低于低密度维持培养。采用平行实验方法专门考察了细胞生长-维持两阶段流加培养过程中的细胞低温维持阶段,分析了各细胞密度条件下的营养物、代谢副产物、环境参数和细胞本身等的差异,尚未发现维持阶段高细胞密度、低抗体融合蛋白表达水平的现象与已知营养物供给、副产物(乳酸、氨)累积、渗透压增高和细胞周期等差异有任何关系。最后,本文以上述GS-CHO细胞的生长代谢特性、化学计量学关系和动力学分析结果为基础,采用理性设计方法设计合理的流加和灌注培养基,平衡营养供应；以葡萄糖为关键控制参数,通过测定培养液中的葡萄糖浓度对其消耗进行及时预测,调整流加/灌注速率,既满足细胞生长代谢和产物合成对营养物的需求,又抑制副产物的累积,缓解/解决营养物消耗和代谢副产物累积之间的矛盾；在此基础上充分利用培养温度和细胞密度对TNFR-Fc抗体融合蛋白比生成速率的影响,采用控制细胞密度和降温维持手段提高GS-CHO细胞抗体融合蛋白表达水平,建立以满足细胞生长代谢需求和提高宿主细胞产物表达水平为基本原则的两阶段动态流加和灌注培养过程设计模型。在此控制模型的指导下,不仅能够较为均衡地提供营养物,而且也有效地控制了代谢副产物的生成和积累,从而大幅度延长了细胞合成抗体融合蛋白的维持时间,提高了过程生产效率。与批式培养过程相比,两阶段动态流加培养过程的培养周期延长了16天,TNFR-Fc抗体融合蛋白比生成速率达到17.37 mg/(109cells-day),提高了1.9倍,浓度达到574mg/L,提高了11倍,目标产物的产率提高了2.4倍。另外,两阶段灌注培养过程的目标产物比生成速率、浓度和反应器体积产率等指标也有不同程度的提高。通过本文的研究工作,建立了经济、高效的GS-CHO细胞两阶段动态流加培养过程和两阶段灌注培养过程,为TNFR-Fc抗体融合蛋白的高效工业化生产奠定了基础。另外,本文所采用的研究方法和控制策略以及对GS-CHO细胞生长代谢所取得的认识,对其它带有GS系统的动物细胞培养过程的研究开发和抗体药物工业化生产过程的优化均有重要的借鉴作用。