髓母细胞瘤是儿童最常见的恶性脑肿瘤，约占儿童全部脑肿瘤的20％。近年来虽然通过改良手术技术，放疗及化疗策略在治疗上取得了很大的进步，但患儿预后仍然不是很理想。髓母细胞瘤目前最主要的治疗方法是手术，配合放化疗。但由于肿瘤恶性程度高，生长迅速，就诊时往往肿瘤巨大并有脑积水，而且患者多为年龄较小的儿童，手术风险大。髓母细胞瘤属于对放疗敏感的肿瘤，但肿瘤细胞易随脑脊液播散，故放射治疗时要做全脑全脊髓放疗，放疗剂量大，对儿童损伤大。化疗作为一种辅助的手段，对儿童毒、副作用严重。髓母细胞瘤预后极差。　　 基因疗法是近年来兴起的新治疗手段，具有非常广阔的前景。然而，由于基因转染靶细胞效率低等原因，基因治疗目前难以取得很好的疗效。增强“旁观者效应”(bystander effect，BE)可以为我们提供了一个更好的途径来解决这个问题。“旁观者效应”是指加入前药后，与导入自杀基因的肿瘤细胞相邻近的未导入自杀基因的肿瘤细胞也被杀死的现象，其明显扩大了自杀基因的杀伤作用。目前许多报道认为旁观者效应与连接素43(Cx43)和细胞间缝隙连接通讯(GJIC)有关。　　 Cx43是一种主要的细胞间隙连接蛋白，在多种正常组织细胞中表达。Cx43表达减少或缺失与多种肿瘤的发生、发展及转移相关，特别是与脑胶质瘤的发生、发展关系极为密切。相邻细胞间通过间隙连接所介导的间隙连接通讯(GJIC)进行细胞间信息和能量交换，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化起着重要的调控作用。在多种肿瘤组织中GJIC功能明显下降。　　 增加Cx43蛋白表达和GJIC功能能够增强旁观者效应。相对于基因转染，化学诱导的Cx43蛋白增加可以影响到更多的癌细胞。目前已经发现许多种类的化学药物诸如类视黄醇、cAMP、类胡萝卜素等都可以增加细胞Cx43的表达量，增强GJIC功能。另有研究发现将Cx43转染进恶性胶质瘤细胞后，随着Cx43蛋白表达的增加，细胞对化疗药物的敏感性也增加了。因此，找到某种化学物质能够提高旁观者效应又能提高细胞对化疗药物的敏感性对于髓母细胞瘤的治疗是非常有意义的。　　 在本研究中，我们用含有HSV-tk基因的小鼠成纤维细胞株PA317病毒上清转染人髓母细胞瘤Daoy细胞，构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统。然后以db-cAMP处理Daoy细胞，通过Western Blot检测Cx43蛋白表达，以划痕标记染料示踪实验(scrape-loading and dye transfer，SLDT)检测了GJIC功能，以MTT法检查了旁观者效应及细胞对化疗药物替莫唑胺(temozolomide，TMZ)和替尼泊苷(teniposide，VM-26)的敏感性。为探讨机理，又用Western Blot检测Bcl-2蛋白表达。通过棉子酚的反向作用探讨了db-cAMP的具体作用机制。　　 材料与方法：　　 1、人髓母细胞瘤Daoy细胞和PA317细胞的培养　　 含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37℃，湿度100%，5%CO2条件的CO2培养箱中培养。一周传代两次。　　 2、逆转录病毒载体转染Daoy细胞　　 将PA317细胞接种在75cm2培养瓶中，高糖DMEM加10%灭活FCS培养。接种24-48h后，收集上清液，滤过后储存于-80℃备用。然后以逆转录病毒载体转染Daoy细胞。首先，将一百万传代Daoy细胞接种在75cm2培养皿中，24h后，将储存的含有病毒载体的细胞上清液加入终浓度为4μg/ml Polybrene，再加入培养皿中培养24h。处理后的细胞以150μg/ml G418筛选两周，用间接免疫荧光法检测转染效率。G418筛选处理后的细胞，两周后得到稳定细胞株Daoy-tk。　　 3、用间接免疫荧光法检测HSV-tk基因在Daoy细胞中的转染效率。　　 4、用RT-PCR法检测HSV-tk基因是否存在，判断是否基因稳定转染进Daoy细胞中。　　 5、用MTT法检测db-cAMP和GCV对Daoy细胞存活率是否有协调作用。　　 6、用Western blot法检测Bcl-2蛋白在db-cAMP处理组和未处理组中的变化。检测了Cx43蛋白单用db-cAMP处理组；和先用db-cAMP，后用棉子酚处理组：db-cAMP未处理组中的变化。　　 7、用划痕标记染料示踪实验检测不同处理组细胞的GJIC功能的变化　　 8、用MTT法检测不同处理组的旁观者效应的变化。　　 9、用MTT法检测db-cAMP处理组和未处理组中的细胞对替莫唑胺和替尼泊苷敏感性的变化。　　 结果：　　 1、逆转录病毒载体转染Daoy细胞成功，获得稳定的Daoy-tk细胞株。　　 2、间接免疫荧光实验显示转染含HSV-tk基因逆转录病毒载体于Daoy细胞后，转染效果较好，Daoy-tk细胞在视野清晰可见。　　 3、通过RT-PCR方法验证，HSV-tk基因在Daoy细胞中稳定转染。　　 4、db-cAMP处理与未经db-cAMP处理的Daoy细胞相比较，无论是处理24小时或是72小时，给予GCV处理后两者存活率无显著性差别。　　 5、db-cAMP(0.5mM)以浓度依赖性方式显著增加Cx43蛋白及磷酸化形式蛋白的表达。当db-cAMP浓度为0.5mM时，细胞中Cx43蛋白表达量相对于对照细胞增加了近2倍；当db-cAMP浓度增加为1mM和1.5mM时，Cx43蛋白表达量增加了近3倍。经db-cAMP处理的Daoy细胞Bcl-2蛋白表达量相对于正常细胞显著降低。　　 6、db-cAMP可以显著增强Daoy细胞GJIC功能，随着培养时间增加，莹黄在经db-cAMP处理的细胞中弥散的速度快于其他两组细胞，差距随时间增大。　　 7、在tk+/tk-细胞比率为20:1-2-5:1时，经db-cAMP处理组细胞较对照组细胞生存率显著降低；当k+/tk-细胞比率降至2-5:1，处理组中仍可以观察到比较明显的旁观者效应，但在未经db-cAMP处理细胞中，比率升至2-2:1时才可以观察到比较明显的旁观者效应。　　 8、db-cAMP可以明显增强TMZ和VM26两种化疗药物对Daoy细胞的细胞毒性。Daoy细胞经db-cAMP处理后，TMZ和VM26两种药物IC50值显著降低；与未处理对照细胞相比，db-cAMP处理的TMZ细胞毒性是对照细胞的3倍，VM26是对照细胞的2倍。　　 结论：　　 1、在人髓母细胞瘤Daoy细胞中成功转入HSV-tk基因，形成稳定Daoy-tk细胞株。经免疫荧光法检测和RT-PCR实验，证实了Daoy-tk细胞株中tk基因的存在。　　 2、db-cAMP能明显增强Daoy细胞中自杀基因治疗的旁观者效应，棉子酚可对抗此增强效应。　　 3、db-cAMP是强力分化诱导子，具有抗增值的效果，GCV是基因治疗中的“前药”，二者对Daoy细胞无协同作用。　　 4、db-cAMP显著上调Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白的表达，而棉子酚显著下调Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白。　　 5、db-cAMP显著增强GJIC功能，棉子酚能对抗此效应。　　 6、db-cAMP能够显著增加Daoy细胞对化疗药物替莫唑胺和替尼泊苷的敏感性。　　 7、db-cAMP能够显著降低Bcl-2蛋白的表达。