杜氏盐藻甘油合成代谢调控的研究

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本文系统进行了氮源、碳源、磷源、盐浓度对杜氏盐藻甘油代谢调控的影响;葡萄糖、NaCl对盐藻中3-磷酸甘油脱氢酶活性的影响;3-磷酸甘油脱氢酶提取和纯化以及动植物抽提液对盐藻固体平板生长影响的研究。 利用本实验室分离纯化得到的无菌藻株A1研究影响杜氏盐藻合成甘油的各种因子,如氮源、碳源、磷源、盐浓度等。氮源中尿素对盐藻单个细胞甘油积累量的影响最大,当盐藻培养至6d时,添加尿素培养液中甘油积累量为25.81 pg/cell,较添加KNO<,3>培养液中甘油积累量高出52.45%。盐藻单个细胞甘油含量随着磷酸二氢钾浓度的增加而上升,0.65g/L 的磷酸盐对提高盐藻单个细胞甘油含量的作用最明显,达到17.99 pg/cell,比浓度为0.01 g/L时的甘油累积量高出39.24%。碳源中葡萄糖对盐藻细胞内甘油含量积累的促进作用最明显,15g/L的葡萄糖效果最佳;当葡萄糖和NaCl以不同的浓度组合添加时,0.5 mol/L NaCl,和15g/L 葡萄糖的组合对盐藻的甘油积累的促进作用最为明显,盐藻培养至第6d时,单个细胞甘油含量达到最大值25.28 pg/cell,较对照提高了124.32%。 葡萄糖对盐藻细胞内甘油积累有显著促进作用,在0~15g/L 范围内葡萄糖的浓度与胞内甘油积累显著相关(y=1.2349x+21.429,R<2>=0.9965),葡萄糖浓度达到15g/L时,胞内甘油积累量达到最高值40.13μg/mL,是对照的2.06倍。葡萄糖对盐藻细胞内总蛋白、3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)酶活和比活都有显著影响,这些值在10~15g/L之间产生较大的变化,但变化幅度与葡萄糖的浓度变化不成比例,在15g/L葡萄糖时这3个值达到最大值,分别是对照的4.384、1.354、3.229倍。数据显示葡萄糖浓度在15g/L 时细胞内蛋白质含量增加不多,但GPDH酶活和比活却大幅度增加。 当NaCl浓度在0.1~2.0mol/L时,单个细胞内的甘油积累量、GPDH酶活及比活均随NaCl浓度的增加而增加,但继续提高NaCl浓度,各值却反而降低,当NaCI浓度为2.0mol/L时以上各值均达到最大,甘油积累量、GPDH酶活及比活分别为3.30pg/cell,0.24μU/cell及9.02,分别是对照的1.38、3.00及4.93倍。与此同时,平均每个细胞蛋白质含量却随着NaCl的增加而降低,当NaCl浓度为2.5mol/L时,蛋白质含量为21.59pg/cell,仅为对照的51%。 离心收集培养12d的藻细胞,冰浴超声破碎,获得粗提液;经2次PEG分级,采用DEAE Sepharose Fast Flow柱纯化蛋白;经0~0.5mol/L NaCl梯度洗脱后,在2个不同NaCl浓度的藻液样品中分别洗脱出2个峰具有GPDH活性,2.0mol/L NaCl浓度样品的GPDH经DEAE纯化后,2个峰所对应的各项值较0.5mol/L NaCl浓度样品的值均有大幅度提高,2.0mol/L NaCl浓度样品的第1峰的总蛋白、总酶活及比酶活分别是0.5mol/L NaCl浓度样品的4.23、4.50和1.06倍,而第2峰对应的总蛋白、总酶活及比酶活分别是0.5mol/L NaCl浓度样品的13.80、69.90和5.07倍,与第1峰相比各项值大幅度增加。数据显示第2峰中可能存在显著受到高浓度NaCl诱导的“渗透调节”型GPDH同功酶。培养至30d时,在添加鱼汤提取物的平板上,形成了较好的单藻落,藻落较大,颜色呈深绿色,而对照平板上的藻落小,呈浅绿色。通过计算植板率,发现随着鱼汤提取物浓度的增加,植板率越高,8%鱼汤提取物浓度的平板植板率是对照平板的6.4倍。
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