母体糖尿病能显著增高人类和动物子代先天畸形的风险。神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是糖尿病妊娠致子代先天畸形中最为严重的畸形之一,同时也是新生儿死亡的主要原因,但糖尿病妊娠致神经管缺陷的分子机理至今仍不清楚。随着糖尿病患病率的增高,神经管畸形的发病率也随之增加,不仅危及患儿的生命和健康,而且给社会和家庭造成沉重的经济负担。为了有效的预防和治疗糖尿病致神经管畸形发生,必须揭示糖尿病妊娠致神经管畸形的发生机理。本研究组及国外一些研究小组的研究发现,高血糖可使发育中的神经上皮过度凋亡,进而导致神经管不能闭合而产生畸形。近年来,氧化应激反应的提出为高血糖致畸机理的研究展示了新思路。提高胚胎组织的氧化应激能力可以减少神经管畸形的发生。有研究显示糖尿病妊娠致畸与高血糖引起胚胎细胞氧化应激而导致神经上皮过度凋亡密切相关。但是,氧化应激是如何引起细胞过度凋亡而产生神经管畸形的,其中的关键分子是什么,至今尚不清楚。近年来本课题组筛选了许多与氧化应激和细胞凋亡相关的基因,c-Abl、Atm和PKC-δ等,其中c-Abl更为我们所关注。在高血糖引起的神经上皮凋亡中,c-Abl的作用及其作用机理至今尚未见报道。神经上皮细胞主要由神经前体细胞构成,因此,我们用神经上皮细胞在体外建立高糖诱导神经前体细胞凋亡模型,采用免疫荧光细胞化学、RNA干涉和Western blot等技术方法,揭示c-Abl在高糖致神经前体细胞凋亡中的作用及作用机理,从而为高血糖致神经管畸形在基因水平上的机理和防治研究提供了重要的理论支持。一、体外高糖诱导神经前体细胞凋亡模型的建立于小鼠妊娠后12.5天应用体视显微镜成功分离胚胎神经管前端脑泡,经机械吹打获取细胞悬液,接种于无血清培养基,获得神经前体细胞(neuralprogenitor cells,NPCs)。应用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记以及巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色技术检测其增殖和更新能力,采用神经元特异性抗体微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)和神经胶质细胞特异性抗体胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色法检测了其分化情况。实验显示,获得的是具有增殖能力和分化潜能的神经前体细胞,可以用于后续实验研究。为了建立体外高糖诱导细胞凋亡模型,实验设定5 mM、25 mM、45 mM、60 mM和100 mM五组葡萄糖浓度,通过MTT法分析细胞活性。同时,用甘露醇作为对照,排除渗透压对细胞的影响。实验发现,葡萄糖浓度为25 mM时细胞的活力最高,这与Maurer等研究者的实验结果一致,说明含25 mM葡萄糖的培养基比较适合神经前体细胞的培养。45 mM浓度组细胞活性明显低于25 mM浓度组,且有显著性差异(P＜0.01)。同浓度的甘露醇对细胞活性没有明显的影响。应用(FITC)-conjugatedannexin V方法,检测不同时间段45 mM葡萄糖诱导神经前体细胞凋亡的具体情况。结果显示,对照组细胞凋亡率为8%,高糖作用24小时后细胞凋亡率为40%。48小时后凋亡率升至57%,说明45 mM葡萄糖浓度能诱导神经前体细胞凋亡,此浓度是高糖诱导神经前体细胞凋亡模型的理想浓度。二、c-Abl在高糖诱导神经前体细胞凋亡中作用的实验研究首先检测c-Abl在高糖诱导神经上皮细胞凋亡中的表达情况。实验分为正常对照组、高糖12 h组、高糖24 h组和高糖48 h组,在mRNA和蛋白水平上,检测c-Abl的表达改变。研究发现,高糖作用12 h后c-Abl的mRNA表达开始增加,持续到48 h后。而c-Abl的蛋白水平在高糖作用24 h(P＜0.01)和48 h(P＜0.01)时明显高于正常组。c-Abl在不同的亚细胞结构定位具有相应的生物学功能。通过免疫双标定位和核、浆分离的方法,检测高糖情况下c-Abl在细胞内的分布变化。研究发现,高糖作用后,胞浆内c-Abl表达没有明显的改变,而胞核的c-Abl水平明显增高,这表明在高糖诱导细胞凋亡时,c-Abl主要在胞核内发挥作用。使用RNA干扰技术抑制c-Abl表达,探讨c-Abl与高糖诱导的细胞凋亡之间的关系。首先设计三组c-Abl的siRNA,确定有效的一组。转染有效的c-Abl siRNA后,Western blot检测c-Abl蛋白水平,结果显示转染12 h后c-Abl的表达出现下降,24 h c-Abl的抑制效果最明显,说明转染后24 h抑制效果最好。通过MTT分析,在高糖条件下,转染c-Abl siRNA后细胞的凋亡比单纯高糖组和转染对照组明显减少(P＜0.05),提示抑制c-Abl能减少高糖诱导的神经细胞凋亡,c-Abl是细胞凋亡过程的关键基因。三、c-Abl在高糖诱导神经前体细胞凋亡中作用机制的实验研究以往研究显示,氧化应激可调节高糖诱导的神经上皮凋亡,为此本部分探讨在高糖条件下,氧化应激与c-Abl的关系。首先,检测高糖时细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化状况。实验发现,加入高糖后6 h,活性氧的产生到达高峰,然后逐渐下降,24 h后接近正常水平。为了探讨氧化应激与c-Abl的关系,高糖组细胞中加入抗氧化剂α-lipoic acid(LA)和c-Abl抑制剂STI571。实验发现,在高糖情况下,加入STI571对细胞内ROS的产生没有明显的影响。而加入LA后,c-Abl的表达明显低于高糖组,且有统计学意义(P＜0.05),这说明c-Abl是氧化应激的下游效应分子。许多研究发现,高血糖是通过p53凋亡途径导致神经上皮凋亡。因此需要检测c-Abl与p53的关系。研究发现在高糖诱导细胞凋亡时,p53的mRNA水平没有明显的变化。但通过核、浆分离检测到,p53在核内的聚集增加(P＜0.05)。通过免疫共沉淀检测,发现c-Abl与p53相互作用,在高糖条件下,二者在核内的复合体增多。加入抗氧化剂LA和c-Abl抑制剂STI571后核内p53的水平也明显下降(P＜0.01)。说明p53的表达可以被ROS和c-Abl调节。为了探讨c-Abl和氧化应激在高糖诱导神经细胞凋亡中的作用,实验高糖组中加入LA和STI571。研究发现,在高糖组中加入STI571和LA后神经细胞凋亡的数目有明显的减少(P＜0.01),说明高糖条件下,ROS-c-Abl信号是神经前体细胞凋亡重要途径。结论:高糖培养可引起神经前体细胞过度凋亡。45mM的葡萄糖致神经前体细胞凋亡作用最理想,从而确认该浓度是研究高糖诱导神经前体细胞凋亡机理的最佳细胞模型浓度。c-Abl基因的高表达在高糖致神经前体细胞凋亡中有明显的促进作用。在高糖诱导神经前体细胞凋亡过程中,高糖可引起细胞内ROS升高,升高的ROS能够促进c-Abl表达增高。c-Abl通过与p53的结合而增加p53核内的表达水平,从而促进细胞凋亡过程。这可能为妊娠糖尿病致神经管畸形的有效预防提供新的思路。同时,此项工作为高血糖致神经管畸形在基因水平上的机理和防治研究提供了重要的理论支持。