研究背景和研究目的近年以来,伴随着逐年升高的发病率,恶性肿瘤已成为人类主要死因之一,其中,在世界184个国家及地区中,中国的发病率位居中上水平[1],每年新增肿瘤病人达到了全球新发病例的21.8%,恶性肿瘤已对我国的居民健康和社会发展造成了重大威胁,对于恶性肿瘤的有效防治也成为我国面临的重要公共卫生问题。恶性肿瘤的形成和发展是一个多基因调控的复杂过程,在这个过程中关键的癌基因和/或抑癌基因发生表达失调,对于这些基因的深入理解有助于从分子层面阐明肿瘤发生发展的机制,也可以促进人们对于恶性肿瘤的精准防治。在众多肿瘤调控基因中,铜代谢基因MURR1结构域(Copper Metabolism MURR1 Domain,COMMD)家族是近年来新发现的一个参与众多肿瘤调控的蛋白家族。该家族共有10名成员,即COMMD1-COMMD10,研究发现COMMD1蛋白在多种肿瘤中低表达且与肿瘤的侵袭密切相关[2,3];COMMD5蛋白在胶质母细胞瘤及肾细胞癌中表达下调,在人胚胎肾细胞株HEK293中过表达COMMD5可减弱细胞的增殖能力[4];有7个COMMD家族成员被认为是BL41 Burkitt’s淋巴瘤细胞株中EB病毒可能作用的靶点[5];近期又有研究显示COMMD10蛋白在结直肠癌中低表达且与病人的不良预后相关,COMMD10通过抑制NF-κB通路的活性来抑制结肠癌细胞的局部浸润和远处转移[6],上述证据证明COMMD家族和多种肿瘤存在密切联系。因为NF-κB通路的异常活化已被证实与多种肿瘤的发生发展密切相关,而COMMD10在结肠癌细胞中可以抑制NF-κκB通路的活化,所以COMMD10可能在多种肿瘤中都发挥了重要作用,但目前关于COMMD10在人类其他肿瘤及对应正常组织中的表达情况及生物学功能尚不清楚。本课题选取COMMD10作为研究靶点,初步探讨COMMD10在人体重要正常组织、常见肿瘤组织以及常用实验动物BALB/c小鼠中的表与分布,通过生物信息学方法挖掘探索其在肿瘤中可能发挥的生物学作用及参与的分子通路,为后续研究COMMD10在人类疾病中发挥的具体作用及相关作用机制奠定基础。研究方法1.COMMD10在BALB/c小鼠不同正常组织中的表达与分布1.1 COMMD10 mRNA在BALB/c小鼠不同组织中的表达情况:提取BALB/c小鼠心、肺、大脑、胃、小肠、脾脏、肝脏、肾脏、胰腺、胸腺等10种新鲜冰冻正常组织中的mRNA,利用荧光定量PCR检测COMMD10在BALB/c小鼠不同组织中的mRNA水平表达情况。1.2COMMD10蛋白在BALB/c小鼠不同正常组织中的分布情况:制作BALB/c小鼠心、肺、大脑、气管、食管、胃、小肠、脾脏、肝脏、肾脏、胰腺、胸腺等12种正常组织的石蜡切片,利用免疫组织化学染色检测COMMD10在BALB/c小鼠不同组织中的蛋白水平表达情况。2.COMMD10在人体正常组织及常见肿瘤组织中的表达与分布差异2.1 COMMD10蛋白在人体重要正常组织和常见肿瘤组织中的分布与表达:收集人体包括肺、食管、胃、肝、肾、结肠、直肠、乳腺、胎盘、前列腺、皮肤、甲状腺、膀胱、宫颈、脾脏、子宫体等16种正常组织和包括肝细胞癌、胆管细胞癌、结肠腺癌、直肠腺癌、乳腺浸润性导管癌、肾尿路上皮癌、肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、子宫肌瘤、子宫内膜癌、胃癌、食管鳞癌、甲状腺乳头状癌、前列腺癌、鼻咽癌、胃肠间质瘤、乳腺小细胞癌、乳腺叶状肿瘤、肺腺癌、胸腺瘤、宫颈癌、膀胱尿路上皮癌等22种常见肿瘤组织标本并制作石蜡切片,利用免疫组织化学染色检测COMMD10蛋白在人体正常组织和常见肿瘤组织中的分布与表达。2.2 COMMD10在不同类型肿瘤和配对正常组织中的表达差异及与预后的相关性:利用TCGA数据库资源分析COMMD10在不同类型肿瘤组织和配对正常组织中的表达差异及COMMD10的表达水平与患者总生存时间、疾病无进展生存时间的相关性。3.COMMD10基因的生物信息学挖掘3.1 COMMD10的基本信息及蛋白互相作用网络分析:利用UCSC网站(http://genome.ucsc.edu/)分析 COMMD10 的基本信息,运用 STRING 网站(https://string-db.org/)来查找已被证实或可能的COMMD10关联基因。3.2 COMMD10及其互作基因的聚类分析:利用DAVID网站(https://david.abcc.ncifcrf.gov/)对COMMD10及其互作基因进行功能聚类分析与KEGG通路分析。3.3 调控 COMMD10 的 miRNA 预测:用 miRDB(http://www.mirdb.org/),miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/),Target Scan(http://www.targetscan.org/),microRNA(http://34.236.212.39/microRNA/home.do)这4个网站对可能调控COMMD10表达的miRNA进行预测,最终对4个预测结果取交集获得目的miRNA。研究结果1.COMMD10在BALB/c小鼠不同正常组织中的表达与分布1.1 COMMD1O mRNA在BALB/c小鼠不同组织中的表达情况:在BALB/c小鼠的心脏、肺、大脑、胃、小肠、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、胸腺等10种组织中,COMMD10的mRNA均有不同程度的表达。其中,COMMD10在肺和脾脏组织中的表达显著高于其他组织,在心脏及大脑组织中的表达显著低于其他组织,胃、小肠、肝脏、肾脏、胰腺、胸腺等组织中COMMD10的表达无显著差异。1.2COMMD10蛋白在BALB/c小鼠不同正常组织中的分布情况:COMMD10蛋白在BALB/c小鼠的胸腺组织中不表达,在心、肺、大脑、气管、食管、胃、小肠、脾脏、肝脏、肾脏、胰腺等11种组织中均有不同程度的表达且主要定位于细胞浆中,其中在各组织的血管内皮细胞和平滑肌细胞可见COMMD10蛋白的普遍表达。2.COMMD10在人体正常组织及常见肿瘤组织中的表达与分布差异2.1 COMMD10蛋白在人体重要正常组织和常见肿瘤组织中的分布与表达:COMMD10蛋白在皮肤、甲状腺、膀胱、宫颈、脾脏等5种组织不表达,在肺、食管、胃、肝、肾、结肠、直肠、乳腺、胎盘、前列腺、子宫体等11种正常组织中均有不同程度的表达,其中在胃、肝、肾组织中高表达,COMMD10蛋白主要定位于细胞浆中,但在肝细胞中,COMMD10蛋白可以同时在细胞浆和细胞核中表达。在肿瘤组织中,COMMD10蛋白在乳腺小细胞癌、乳腺叶状肿瘤、肺腺癌、胸腺瘤、宫颈癌、膀胱尿路上皮癌等6种肿瘤组织中不表达,在鼻咽癌、胃肠间质瘤等2种肿瘤组织中高表达,在肝细胞癌、胆管细胞癌、结肠腺癌、直肠腺癌、乳腺浸润性导管癌、肾尿路上皮癌、肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、子宫肌瘤、子宫内膜癌、胃癌、食管鳞癌、甲状腺乳头状癌、前列腺癌等14种肿瘤中低表达,COMMD10蛋白定位于肿瘤细胞的细胞浆中。2.2COMMD10在不同类型肿瘤和配对正常组织中的表达差异及与预后的相关性:COMMD10在肺鳞癌、浸润性乳腺癌、肾透明细胞癌这3种肿瘤组织中的表达水平与配对正常组织存在显著差异,COMMD10在浸润性乳腺癌组织中的表达上调,在肺鳞癌、肾透明细胞癌组织中的表达下调。在肾透明细胞癌中,COMMD10高表达的患者总生存时间显著高于COMMD10低表达的患者,COMMD10的低表达预示着肾透明细胞癌患者的不良预后。3.COMMD10基因的生物信息学挖掘3.1 COMMD10的基本信息及蛋白互相作用网络分析:运用STRING网站对COMMD10进行蛋白互相作用网络分析,结果显示有41个基因与COMMD10关联,这些基因分别是 RBX1、ATP7B、SLC31A2、C14orf1 66、TCEB2、COMMD9、CP、COMMD4、COMMD10、COMMD7、ATP11A、ZER1、ARAP2、COMMD5、MORN4、COMMD1、DSCR3、ATOX1、ASB4、PSMG1、PNRC2、WARS、COMMD6、NPEPL1、CCDC151、MCMBP、FAM45A、SLC31A1、TFDP1、IARS、CCDC22、CCDC93、COMMD3、COMMD8、VPS29、ENSG00000215700、RELA、C16orf62、SH3GLB1、COMMD2、CUL2 等。3.2 COMMD1O及其互作基因的聚类分析:运用DAVID网站(https://david.abcc.ncifcrf.gov/)对COMMD10及其互作基因进行功能富集分析,结果显示COMMD10及其互作基因主要参与形成Cullin-RING泛素连接酶复合体、核内体等细胞成分,其富集的分子功能主要指向:铜离子的结合及转运,与泛素化蛋白连接酶结合并调控其活性,调控NF-κB通路等,其参与的生物学过程主要包括:铜离子的运输及稳态维持,DNA的转录、翻译及蛋白质的运输,负向调节NF-κB转录因子的活性;在KEGG通路分析中,这些基因被发现与肾细胞癌中的通路、HIF-1信号通路、泛素化介导的蛋白水解、胞吞作用、矿物质吸收等相关。3.3 调控 COMMD1O 的 miRNA 预测:使用 miRDB(http://www.mirdb.org/),miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/),Target Scan(http://www.targetscan.org/),microRNA(http://34.236.212.39/microRNA/home.do)这4个网站对可能调控COMMD10表达的miRNA进行预测,在miRDB数据库中得到24个相关的miRNA,在microRNA数据库中得到27个相关的miRNA,在Target Scan数据库中得到566个相关的miRNA,在miRWalk中得到1430个相关的miRNA,最终对4个预测结果取交集得到1个共同的miRNA:hsa-miR-590-3p。结论1.COMMD1O mRNA在BALB/c小鼠的重要组织中均有表达,在脾脏和肺组织中表达最高,心脏及大脑组织中表达最低。2.COMMD10蛋白在BALB/c小鼠的胸腺组织中不表达,在其他重要组织中均有不同程度的表达,主要定位于细胞浆。3.COMMD10蛋白在人体正常的胃、肝、肾组织中高表达,在血管内皮及平滑肌组织普遍表达,其中在正常肝细胞中同时定位于细胞浆和细胞核,在其它细胞中均于细胞浆表达。此外COMMD10蛋白在多种常见人体肿瘤组织中也有不同程度的表达,主要定位于肿瘤细胞细胞浆中。4.COMMD10预示着肾透明细胞癌的良好预后。创新性1.首次从mRNA及蛋白水平阐述COMMD10在BALB/c小鼠不同组织中的表达及分布情况。2.首次提出COMMD10在肾透明细胞癌中可能具有抑癌作用。3.预测COMMD10在肾透明细胞癌中可能的作用机制。